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糙皮侧耳降解利用木质纤维素的机理研究

发布时间:2020-09-08 21:10
   糙皮侧耳作为我国大宗栽培的食用菌之一,可以利用农林废弃物,在适宜环境条件下进行菌丝生长,进而形成以子实体为优质蛋白来源的产业。该菌对木质纤维素的利用效率是提升产量和品质的关键要素。虽然国外对模式真菌的木质纤维素降解研究有大量报道,但是对糙皮侧耳的降解能力,底物偏好性,降解相关的酶和调控基因以及降解相关的基因家族的进化过程等方面的研究薄弱。正是这些理论研究的匮乏,使得中国食药用菌的栽培和育种产业创新性不强,出现单产低、品质差、产业链不连续或过短等多方面问题。因此,开展对该菌降解利用木质纤维素的机理研究对日后发展食用菌产业具有重要的理论意义。本研究主要对糙皮侧耳的基础生理生化特性,对基质的降解偏好性及具体的降解过程,降解过程中与木质素利用相关的基因、酶以及生命途径,以及在漫长的进化史中该菌木质纤维素降解相关基因家族的变化这4方面开展了研究。采用了诱导定性培养基,酶活测定以及傅里叶红外光谱法和X射线衍射法对糙皮侧耳的降解能力以及降解过程进行研究;采用不同处理以及不同基质下的RNA转录表达水平对其降解利用木质纤维素的相关基因,所涉及的酶以及生命途径进行研究;采用RAxML 7.2.8建立系统发育树以及R8s、CAFE以及BadiRate软件进行分子钟以及基因的进化变异程度的分析,从而研究重要的基因家族的进化过程。糙皮侧耳的生理生化特性以及降解过程的研究结果表明:该菌具有较好的MnP以及GLOX分泌能力,纤维素酶分泌能力一般;该菌在降解木质纤维素时更偏向于对木本植物的利用,当降解利用杨树木屑时,其羧甲基纤维素酶、木聚糖酶以及漆酶的活性比降解玉米秸秆时活性分别约增高17.1%、20%以及400%。且先对底物细胞壁中的酸不溶木质素进行降解,进而对纤维素展开利用,它所分泌的酶一定程度上可以作用于晶胞纤维素,四周以后可以降低0.6%的纤维素结晶度,这与褐腐菌降解无定形纤维素的表现有很大不同;该菌子实体的生长会受到金属铜离子与芳香族化合物愈创木酚、发菌期与出菇期的时间长短、温湿度以及是否催菇的影响;不同比例的栽培料配置也会影响该菌子实体的生物转化率。不同处理以及不同基质的糙皮侧耳转录组分析研究的结果表明:糙皮侧耳具有多种木质素降解的同工酶,且它们对不同的基质有不同的表达水平。其中共9个unigene会受CuCl2影响表达下调,与酶活的表达结果一致,有可能是MnP以及GLOX的控制基因,其主要影响到Mn2+的转运以及乙酰辅酶A的形成。木质素可以诱导5个编码 MnP 的基因,Cluster-3993.31508、Cluster-3993.26196、Cluster-3993.5545、Cluster-3993.5546、Cluster-3993.16055,主要调控 MnP3、MnP6 以及短段 MnP;2 个编码 Laccase 的基因,Cluster-3993.5216、Cluster-3993.9428,主要调控 laccase POXA3a以及Laccase-2;1个芳香族降解酶相关基因,Cluster-3993.22471,参与芳香族复合物的代谢反应;2个细胞色素P450相关基因,Cluster-3993.29594、Cluster-3993.16820,主要参与多环芳烃中的芳香基的转化。同时KEGG及GO富集分类结果表明:糙皮侧耳在降解利用木质纤维素时,主要涉及到利用锰过氧化物酶、漆酶以及乙二醛氧化酶的次生代谢途径,多种辅酶参与的催化反应以及细胞色素P450与芳香族复合物氧化酶参与的异生物质代谢这些生命过程。糙皮侧耳与其他39株食药用菌做比较基因组学分析研究的结果表明:CBM1、GH6以及GH7是该菌降解纤维素的重要基因家族;AA1、AA2以及AA5是该菌降解木质素的重要基因家族;CYP53以及CYP64是该菌细胞色素P450的主要基因家族组成。经过三类家族基因不断地膨胀与收缩,糙皮侧耳P.ostreatus于9 400万年年前出现,并表现出较强的木质素降解能力。该菌作为白腐菌,在漫长的进化史中具有丰富的木质素降解酶基因家族的种类,并且在基因的数量上也占有很大优势;不同降解家族基因的种类及数量直接影响该菌日后所具有的生态习性。
【学位单位】:北京林业大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2017
【中图分类】:X70;S646.14
【部分图文】:

锰过氧化物酶,催化循环


将Mn3+固定,促使其从酶的活性位点中释放出来,转而充当一种氧化还原调节剂,逡逑直接将酚型物质或非酚类芳香族物质氧化成对应的自由基,接着发生一连串的自由基逡逑链式反应,最终实现对木质素的降解(如图1-3)邋(Glenn,邋1983;邋Hofrichter,2002)。逡逑H;Oj逦H;0逡逑广、逡逑Proenzyme逦Complex邋I逡逑Fea逦Fe*=OIP-]逡逑f逦AHJ逦s逡逑Mb3逦八逦f逦^逡逑A邋'(邋V逦A*/(邋rAH逡逑卜逡逑AH逦-邋H>0:逦A逡逑Complex邋ill逡逑Fe°-02逡逑图1-3锰过氧化物酶的催化循环逡逑Fig.邋1-3邋The邋catalytic邋cycles邋of邋manganese邋peroxidase邋(MnP)逡逑7逡逑

氧化催化,细胞色素


合物合成(Ctoura,1999),同时还可能参与到了木质素降解代谢中(Morin邋etal.,逡逑2012)。P450典型的氧化过程是将分子氧还原,同时利用一些辅酶(如NADPH、FAD)逡逑进行电子传递,并将一个氧加入到底物中,完成氧化过程(如图1-4)。逡逑AH逡逑Fe^V邋e-邋FP-逡逑(逦NADP-邋^^FADH:逦2(F^ ̄逦^邋^逡逑VNADPH-H*逦FAD逦2^e-S'^邋j邋e.逡逑H:0逦]逦P4j0-AH邋\邋P4S?JAH逡逑\逦m逦Fe-'-邋o:-邋J邋Fe*T邋0:逡逑,■>_^逡逑AOH逡逑图1-4细胞色素P450的氧化催化循环逡逑Fig.邋1-4邋The邋catalytic邋cycles邋of邋cytochromes邋P450逡逑1.2.2.降解纤维素的相关酶逡逑纤维素是脱水葡萄糖单体通过糖苷键相连,糖链之间又以氢键相互束缚形成的纤逡逑维束,最终聚合成高分子纤维素大分子,约占木质纤维素的35?50%。在分子中,还逡逑因排列规整与否分为结晶区和无定形区(陈家楠,1993)。自然界中的纤维素主要存逡逑在于植物细胞中,而随着工业发展与能源日益紧张,生物能源的开发已经成为世界热逡逑点,其中利用纤维素酶将纤维素解聚进而通过糖酵解等过程生产生物乙醇就是纤维素逡逑的重要作用之一(孟sィ玻埃保埃e义希瑰义

本文编号:2814640

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