柑橘中类黄酮新橘皮糖苷代谢关键基因分离和功能分析
发布时间：2020-09-09 11:10
柑橘风味中的苦味作为其重要的品质性状而备受关注。类黄酮中的新橘皮糖苷类(Neohesperidoside;NEO)是影响柑橘果实前苦味(‘primary’bitterness)的主要物质,且其在柑橘果实中的代谢差异一直是近些年的研究热点。柑橘种属关系复杂、突变材料和种质资源多样,丰富的次生代谢差异性使其成为研究类黄酮的理想材料。因此,从生理和分子水平上对柑橘进行种质资源评价以及苦味形成机理进行探讨具有特殊优势且对产业发展意义重大。本研究首先对种植广泛但不积累NEO的甜橙果实组织进行类黄酮的定性和定量分析,初步研究甜橙中类黄酮的组成以及随果实发育的含量变化;其次,克隆不同柑橘种质中调控NEO合成的1,2RhaT(1,2-rhamnosyltransferase gene),分析该基因序列的多态性与不同种质中苦味品质产生的相关性,并利用自然群体和杂交群体提供更多遗传学依据;最后,探索柚中与NEO代谢有直接竞争关系的代谢支路,利用基因转化BY2烟草悬浮细胞系对1,2RhaT-like蛋白d GlcT进行功能表征分析,且通过转录组以及基因表达定量分析数据阐明d GlcT和1,2RhaT在柑橘类黄酮代谢中的竞争作用。主要研究结果如下:1.以两个红肉甜橙(‘红肉’和‘红暗柳’)和两个普通果肉甜橙(‘清家’和‘暗柳’)不同发育期果实四个组织(黄皮层、白皮层、囊衣和汁胞)为材料,通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)法结合添加内标实验,初步鉴定了甜橙果实各组织中黄烷酮糖苷和聚甲氧基黄酮的组成,并利用液相色谱(HPLC)法进行定量分析。结果显示,甜橙各组织中所检测的四种黄烷酮糖苷类均属于芸香糖苷类(Rutinoside;RUT),与NEO的前体物质相同,但并不具有苦味,表明甜橙在NEO代谢上并没有遗传柚的性状;对甜橙中Cs1,2RhaT-like基因进行克隆分析,发现一条与Cm1,2RhaT(Gen Bank accession:AY048882)核苷酸序列同源性为92%的候选基因,但其编码区出现两处单碱基缺失,此基因的移码突变可能是导致甜橙中类黄酮NEO无法合成的直接原因。2.对柑橘各种属不同栽培种中1,2RhaT基因及其高度同源序列进行克隆,并结合柑橘基因组数据库进行比对分析,发现柑橘基因组中拥有两类与Cm1,2RhaT高度同源且被注释作为1,2RhaT-like的基因。一类具有丰富的序列多态性(命名为d GlcT-1),其编码的氨基酸序列与Cm1,2RhaT同源性高达88%,且仅在个别柚种质中能扩增到完整的编码区序列;另一类则包括两个基因(命名为d GlcT-2和d GlcT-3),其编码的氨基酸序列与Cm1,2RhaT同源性均为67%,且以串联复制的方式广泛分布在各柑橘种质的基因组中。3.对分属柑橘属、枳属和金柑属的50个柑橘栽培种进行1,2RhaT及1,2RhaT-like(d GlcT-1,d GlcT-2和d GlcT-3)基因型与柚皮苷积累表现型的关联分析,发现仅1,2RhaT与枳属和柑橘属果实中柚皮苷的积累直接相关。此外,通过红橘×枳壳以及HB柚×Fairchild杂交群体分析表明,含完整1,2RhaT序列的杂交子代(对比Cm1,2RhaT,AY048882;NCBI)果实能正常合成柚皮苷,相反则不能,进一步证明1,2RhaT对柑橘属和枳属中柚皮苷的合成具有重要作用。值得关注的是,尽管具有完整的1,2RhaT序列,但金柑属各种质中依然无法积累柚皮苷或者黄烷酮糖苷类,且将凤凰柚中的Cm1,2RhaT转化山金柑后依然无法检测到柚皮苷的产生,预示着金柑属中橘皮糖苷类的代谢缺失并非由1,2RhaT所致。4.研究结果同时表明,1,2RhaT-like基因与柑橘中NEO的产生并无直接关联性。因此,通过基因转化烟草BY2悬浮细胞体系对Cmd GlcT-1,Csd GlcT-2以及Cm1,2RhaT进行了功能验证及功能差异分析。结果显示,d GlcT-1和d GlcT-2是一个底物广泛的类黄酮-7-O-二-葡萄糖苷转移酶,最优底物是黄烷酮-7-O-葡萄糖苷;d GlcT不具有1,2RhaT功能且无法催化NEO的形成,但是其催化产物与类黄酮NEO可共用黄烷酮/黄酮-7-O-葡萄糖苷作为直接前体,两者间可能存在直接的底物竞争关系。但是,虽然有功能,d GlcT的代谢产物在果实整个发育期内含量均极低,转录组和基因表达定量分析结果表明在果实发育初期,NEO或者RUT对底物的强烈竞争导致其代谢受阻;随着果实的成熟,流向类黄酮代谢底物的供应不足可能是类黄酮-7-O-二-葡萄糖苷乃至整个类黄酮糖苷类代谢受阻的主要原因。通过对柑橘NEO特别是柚皮苷代谢积累机理的研究,为揭示柑橘前苦味形成机制奠定了理论基础。而d GlcT的发现,对间接改变柚果实中NEO的积累进而改善果实苦味有着重大意义。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S666
【部分图文】：
华中农业大学 2017 届博士研究生学位论文以及减少类黄酮的化学毒性等（Vogt and Jones 2000, Brenda 2001, Bowles et al 2005Koes et al 2005）。植物中的类黄酮糖苷类主要分为两类：一类是将糖分子以C-C键直接连接于类黄酮糖苷配基上或者以O-linked的方式连接于类黄酮糖苷配基的羟基上的单糖苷转移酶类；另一类则是催化在原有糖苷键上继续连接糖分子的多糖苷转移酶类（Jones and Vogt 2001, Masada et al 2009, Vukics and Guttman 2010, Nagatomo et a2014）。在植物中，用于糖基化反应的糖分子主要是葡萄糖和鼠李糖，而阿拉伯糖、木糖以及葡萄糖醛酸则所用较少（Jay et al 2006, Williams 2006）。据不完全统计，目前柑橘中已确定的生物类黄酮已超过80种，分属黄烷酮、黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花青素几类（表 1-1；图 1-1）（陈嘉景等 2016）。且以黄烷酮-O-糖苷类、黄酮-O糖苷类和黄酮-C-糖苷类含量最为丰富（Gattuso et al 2007,Abad-Garcia 2014）。
图 1-2 柑橘中黄烷酮糖苷类的代谢柑橘中苯丙烷代谢途径（A）和主要的黄烷酮糖苷类代谢途径（B）(参考自 Frydman et al 2004,Owens et al 2011, Chen et al 2015c)。PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸 4-羟化酶；4CL，4-香豆酰辅酶 A 连接酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查尔酮异构酶；7-GlcT，黄烷酮 7-O-葡萄糖转移酶；1,2RhaT，1,2 鼠李糖基转移酶；1,6RhaT，1,6-鼠李糖基转移酶。Fig. 1-2 Metabolic pathways of flavanone glycosides in citrusMetabolic pathways of phenylpropanoid (A) and predominant flavanone glycosides (B) in citrus(modified from Frydman et al. 2004, Owens et al. 2011, Chen et al. 2015c). PAL, phenylalaninammonia-lyase; C4H, cinnamate-4-hydroxylase; 4CL, 4-coumarate:coenzyme A ligase; CHS, chalconesynthase; CHI, chalcone isomerase; F3'H, flavanone 3'-hydroxylase; 7-GlcT, flavanone7-O-glucosyltransferase; 1,2RhaT, 1,2-rhamnosyltransferase; 1,6RhaT, 1,6-rhamnosyltransferase.黄烷酮糖苷类大量存在于柑橘属的果实中且以白皮层和囊衣中的含量最高，而在黄皮层和汁胞中的含量较低（Nogata et al 2006, Zhang et al 2014b）。另外，在叶片、花、皮、根等部位也有少量的积累（Lim 2012）。黄烷酮类在柑橘果实中的代谢存在
图 1-3 柑橘中主要的二氢黄酮醇类（A）、花青苷类（B）和黄酮醇类（C）代谢途径参考自 Piero et al 2006，Gou et al 2011，Lo Piero 2015。F3H，黄烷酮-3-羟化酶；F3’H，类黄酮-3’-羟化酶；F3’5’H，类黄酮-3’5’-羟化酶；DFR，二氢黄酮醇还原酶；ANS，花青素合成酶；3-Glct，黄酮醇 3-葡萄糖苷转移酶；UGTs，UDP 依赖的糖苷转移酶类；ATT，酰基化转移酶类；FLS，黄酮醇合成酶；OMT，O-甲基化转移酶；1,6Rhat，1,6-鼠李糖基转移酶。Fig. 1-3 Metabolic pathways of predominant dihydroflavonols (A), anthocyanins (B) andflavonols (C) in citrusModified from Piero et al. 2006, Gou et al 2011, Piero 2015. F3H, flavanone-3-hydroxylase; F3'H,flavonoids-3'-hydroxylase; F3'5'H, flavonoid-3',5'-hydroxylase; DFR, dihydroflavanol-4-reductase;ANS, anthocyanidin synthase; 3-Glat, flavonol-3-O-glucosyltransferase; UGTs,UDP-Glycosyltransferases; ATT, acyltransferases; FLS, flavonol synthase; OMT, O-methyltransferase;1,6Rhat, 1,6-rhamnosyltransferas.FLS 通过催化三种黄烷醇代谢前体分别形成山奈酚、槲皮素和杨梅素而参与到
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S666
【部分图文】：
华中农业大学 2017 届博士研究生学位论文以及减少类黄酮的化学毒性等（Vogt and Jones 2000, Brenda 2001, Bowles et al 2005Koes et al 2005）。植物中的类黄酮糖苷类主要分为两类：一类是将糖分子以C-C键直接连接于类黄酮糖苷配基上或者以O-linked的方式连接于类黄酮糖苷配基的羟基上的单糖苷转移酶类；另一类则是催化在原有糖苷键上继续连接糖分子的多糖苷转移酶类（Jones and Vogt 2001, Masada et al 2009, Vukics and Guttman 2010, Nagatomo et a2014）。在植物中，用于糖基化反应的糖分子主要是葡萄糖和鼠李糖，而阿拉伯糖、木糖以及葡萄糖醛酸则所用较少（Jay et al 2006, Williams 2006）。据不完全统计，目前柑橘中已确定的生物类黄酮已超过80种，分属黄烷酮、黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花青素几类（表 1-1；图 1-1）（陈嘉景等 2016）。且以黄烷酮-O-糖苷类、黄酮-O糖苷类和黄酮-C-糖苷类含量最为丰富（Gattuso et al 2007,Abad-Garcia 2014）。
图 1-2 柑橘中黄烷酮糖苷类的代谢柑橘中苯丙烷代谢途径（A）和主要的黄烷酮糖苷类代谢途径（B）(参考自 Frydman et al 2004,Owens et al 2011, Chen et al 2015c)。PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸 4-羟化酶；4CL，4-香豆酰辅酶 A 连接酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查尔酮异构酶；7-GlcT，黄烷酮 7-O-葡萄糖转移酶；1,2RhaT，1,2 鼠李糖基转移酶；1,6RhaT，1,6-鼠李糖基转移酶。Fig. 1-2 Metabolic pathways of flavanone glycosides in citrusMetabolic pathways of phenylpropanoid (A) and predominant flavanone glycosides (B) in citrus(modified from Frydman et al. 2004, Owens et al. 2011, Chen et al. 2015c). PAL, phenylalaninammonia-lyase; C4H, cinnamate-4-hydroxylase; 4CL, 4-coumarate:coenzyme A ligase; CHS, chalconesynthase; CHI, chalcone isomerase; F3'H, flavanone 3'-hydroxylase; 7-GlcT, flavanone7-O-glucosyltransferase; 1,2RhaT, 1,2-rhamnosyltransferase; 1,6RhaT, 1,6-rhamnosyltransferase.黄烷酮糖苷类大量存在于柑橘属的果实中且以白皮层和囊衣中的含量最高，而在黄皮层和汁胞中的含量较低（Nogata et al 2006, Zhang et al 2014b）。另外，在叶片、花、皮、根等部位也有少量的积累（Lim 2012）。黄烷酮类在柑橘果实中的代谢存在
图 1-3 柑橘中主要的二氢黄酮醇类（A）、花青苷类（B）和黄酮醇类（C）代谢途径参考自 Piero et al 2006，Gou et al 2011，Lo Piero 2015。F3H，黄烷酮-3-羟化酶；F3’H，类黄酮-3’-羟化酶；F3’5’H，类黄酮-3’5’-羟化酶；DFR，二氢黄酮醇还原酶；ANS，花青素合成酶；3-Glct，黄酮醇 3-葡萄糖苷转移酶；UGTs，UDP 依赖的糖苷转移酶类；ATT，酰基化转移酶类；FLS，黄酮醇合成酶；OMT，O-甲基化转移酶；1,6Rhat，1,6-鼠李糖基转移酶。Fig. 1-3 Metabolic pathways of predominant dihydroflavonols (A), anthocyanins (B) andflavonols (C) in citrusModified from Piero et al. 2006, Gou et al 2011, Piero 2015. F3H, flavanone-3-hydroxylase; F3'H,flavonoids-3'-hydroxylase; F3'5'H, flavonoid-3',5'-hydroxylase; DFR, dihydroflavanol-4-reductase;ANS, anthocyanidin synthase; 3-Glat, flavonol-3-O-glucosyltransferase; UGTs,UDP-Glycosyltransferases; ATT, acyltransferases; FLS, flavonol synthase; OMT, O-methyltransferase;1,6Rhat, 1,6-rhamnosyltransferas.FLS 通过催化三种黄烷醇代谢前体分别形成山奈酚、槲皮素和杨梅素而参与到
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5 李e
本文编号：2814900
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