石榴抗寒品种筛选及转录因子PgCBF1功能分析

发布时间：2020-09-19 22:49

　　 石榴(Punica granatum L.)起源于中亚、西亚地区,喜温畏寒,在我国中、北部地区栽培容易遭受冻害。冻害严重制约了我国石榴产业的发展,所以本研究主要从两个方面开展工作:综合评价6个石榴品种的抗寒性,筛选出可靠的石榴抗寒性鉴定指标,再用此指标从80份石榴品种中筛选抗寒品种作为抗寒砧木或者培育抗寒品种的亲本;用PgCBF1过量表达拟南芥初步分析石榴转录因子PgCBF1的功能,为石榴抗寒性分子机理研究奠定基础,为抗寒品种的培育提供依据。主要结果如下:1、休眠期取6个石榴品种的一年生枝条测组织含水量,并进行5个温度的冷胁迫处理,处理之后测一些生理、生化指标的变化。最后用隶属函数法综合评价这6个品种的抗寒性,抗寒性由强至弱依次为:‘三白’、‘陕大籽’、‘蒙自甜绿籽’、‘青皮软籽’、‘突尼斯软籽’、‘以色列2号’。这一结果与相对电导率(REC)得出的顺序一致,所以用REC评价石榴抗寒性是种可靠的方法。采用REC评价80份石榴品种的抗寒性得出,抗寒性最强的‘新疆红皮’可以作为抗寒砧木或者培育抗寒品种的亲本。2、qRT-PCR分析表明PgCBF1在‘突尼斯软籽’根、茎、叶、花、果皮、种子组织中表达量没有显著差异。把扩增得到PgCBF1目的片段与克隆载体pEASY-Blunt Zero连接,克隆得到目的片段。生物信息学分析可知PgCBF1的开放阅读框(ORF)全长714 bp,编码237个氨基酸,蛋白分子量25.89 kDa,等电点5.69。PgCBF1属于AP2/ERF家族,为典型的DREB1/CBF转录因子,且与拟南芥DREB1/CBF转录因子的相似性较高。3、构建pBI121-PgCBF1表达载体,通过农杆菌遗传转化获得转基因阳性植株。表型观察发现,PgCBF1过表达拟南芥叶片明显变小,叶柄变短,叶片颜色更绿;生长缓慢,开花延迟20 d左右,部分植株甚至不开花;花序明显短于野生型拟南芥。冷胁迫下,过表达拟南芥下游冷胁迫相关基因(COR15A、COR15B、RD29A、RD29B、RD22、COR47)表达量上调幅度大于野生型拟南芥。把PgCBF1过表达拟南芥和野生型拟南芥-10℃,处理4 h,处理完成后恢复生长10 d。结果显示野生型拟南芥大部分叶片发黄枯萎,而过表达拟南芥依然正常生长。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S665.4
【部分图文】：

COR15B RT-F TACCCTCTACRD29A RT-F TTACGGTTTRD29A RT-R GCGAGTCTCRD29B RT-F GCTGAGAAGRD29B RT-R CTCTTCCCCRD22 RT-F GAGAACGGGRD22 RT-R ACACAACATCOR47 RT-F CGGTACCAGCOR47 RT-R GGACGTGA表达分析量分析 PgCBF1 在石榴根、茎、叶、花、果皮、种子中 6 个组织中的表达并无明显差差异，在叶片中表达量M 根 茎 花 叶 果皮 种子

0.400.500.600.700.800.90根 茎 花 叶 果皮 种子对表达量相Relativeexpre组织Tissues图 3.2 PgCBF1 的组织相对表达量Fig. 3.2 Relative expressions level of PgCBF1 in tissues.2 PgCBF1 基因的克隆以石榴叶片 RNA 逆转录得到的 cDNA 为模板，用高保真酶进行 PCR 扩增目的片段段进行胶回收，将回收的目的片段与 pEASY-Blunt Zero 克隆载体连接，转化大肠杆R 检测阳性克隆，酶切验证后，送生工公司进行测序，测序结果与全基因组得出的序图 3.4 所示。M － M－M

图 3.4 测序结果注：划线处为酶切位点Fig. 3.4 Result of sequence analysisNote: Underlined part of restriction enzyme cutting sitegtggctgtcctcgccctccgcggtcgctccgcctgcctcaacttcgccgactccgcgtggcggcttcccatcccgagctcagcctc3)gGGgGGgGGcCCgGGgGGcCCgGGgGGcCCcCCaAAtTTtTTgGGaAAgGGgGGcCCtTTgGGcCCaAAgGGaAAaAAgGGtTTgGGtTTtTTtTTcCCgGGgGGcCCaAAgGGgGGcCCtTTcCCgGGcCCcCCaAAgGGgGGaAAgGGgGGgGGaAAgGGcCCcCCtTTcCCcCCtTTcCCcCCtTTcCCcCCaAAgGGcCCaAAgGGtTTgGGgGGcCCcCCtTTgGGaAAaAAgGGcCCaAAcCCgGGaAAgGG3)cCCgGGcCCaAAgGGaAAgGGtTTcCCgGGaAAgGGcCCaAAgGGcCCgGGgGGcCCaAAgGGcCCgGGcCCtTTgGGaAAtTTtTTtTTgGGaAAgGGaAAgGGcCCcCCgGGaAAgGGgGGaAAgGGgGGaAAcCCcCCgGGgGGcCCaAAtTTaAAcCC

【参考文献】

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本文编号：2823095