梅花花香相关基因PmCFATs的克隆和表达分析
发布时间：2020-09-24 12:47
花香是观赏植物的重要特征之一,对植物的生存繁殖有重要意义,其产品在食品、保健、化工等方面具有重要的经济价值。梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是中国的传统名花,能释放愉悦的香气,深受中国人民的喜爱。本课题组前期研究表明,丁子香酚是梅花的特征香气成分之一。松柏醇酰基转移酶(CFAT)和丁子香酚合酶(EGS)参与丁子香酚的生物合成途径的最后两步,CFAT是丁子香酚代谢与木质素代谢分开的节点基因。而目前对CFAT的研究很少,梅花丁子香酚代谢的研究刚刚起步。本论文采用生物信息学方法对梅花基因组中的候选CFAT进行了分析和鉴定,以梅花品种'三轮玉碟'为试验材料,应用RT-PCR技术首次在梅花中克隆得到松柏醇酰基转移酶基因,通过生物信息学分析、亚细胞定位、表达模式分析、原核表达以及真核表达载体构建和转化对其功能进行了初步探索,主要结果如下:1.经BlastP检索从梅花基因组数据库中获得86个候选CFAT,其在进化上分为五大分枝,根据对序列、保守基序和进化关系的分析,初步预测第Ⅱ分枝的Pm030674、Pm013138、Pm030672、Pm023001可能是梅花的松柏醇酰基转移酶基因。经克隆得到3个松柏醇酰基转移酶基因的全长cDNA,分别命名为PmCFA T1a、PmCFA T1b、PmCFA T2,其序列全长均为1383bp,编码460个氨基酸,预测分子量分别为51.61 kDa、51.54 kDa、50.92 kDa,属于不稳定的酸性蛋白。PmCFA T1a、PmCFAT1b是Pm030674在'三轮玉碟'中的等位基因。序列比对和系统进化分析显示,PmCFATs与已鉴定的松柏醇酰基转移酶功能基因具有较高的同源性。2.利用pSuper1300-GFP构建了 PmCFATs的GFP融合表达载体,通过在烟草叶片中的瞬时表达进行亚细胞定位,结果显示:PmCFAT1a、PmCFAT1b、PmCFAT2均定位于细胞质和细胞核。3.应用qRT-PCR技术对PmCFA Ts在'三轮玉碟' 6个不同开花时期和5个不同部位中的表达模式进行分析,发现PmCFA T1主要在雄蕊和花瓣中表达,在叶片中无表达;其表达量随开花进程上升,盛花期达到最高,后开始下降,与丁子香酚的释放规律有很强的相关性,推测PmCFA T1作为PmEGS2上游的关键基因,参与了丁子香酚的合成。PmCFA T2在叶片中的表达量高于花朵,在各部位和开花进程中的表达均不符合丁子香酚的合成、释放规律。4.利用pET-28b构建了 PmCFA T1a、PmCFAT1b、PmCFAT2的原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达出与预测分子量相符的蛋白,大小分别约为52 kDa、52 kDa、51 kDa。融合蛋白以包涵体形式表达,当使用优化诱导条件:0.2 mM的IPTG,16℃诱导14h时,蛋白溶解性有所提高,但大部分仍形成了包涵体。利用pCHF3301构建了 PmCFA T1a、PmCFA 71b、PmCFA T2、PmEGS2的单基因植物表达载体和双基因植物表达载体 pCHF3301-PmEGS2-PmCFAT1a、pCHF3301-PmEGS2-PmCFAT1b、pCHF3301-PmEGS2-PmCFAT2,以及潮霉素筛选抗性植物表达载体pSuper1300-PmCFA T1a、pSuper1300-PmCFAT1b、pSuper1300-PmCFAT2,并对矮牵牛进行了初步转化和Basta筛选。本研究对梅花松柏醇酰基转移酶基因进行了克隆,表达分析和功能的初步探索,为进一步分析基因功能,理清梅花丁子香酚的代谢通路,以及深度挖掘梅花BAHD家族基因奠定了基础。
【学位单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S685.17;Q943.2
【部分图文】：
－逦引言逡逑酸解l#酶（ｐｈｂｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，邋ＰＡＬ）催化生成反式肉桂酸（ｄ，ＣＡ）。可见；ＰＡＬ与ＰＡＡＳ两种酶共同竞争底物苯丙l#酸。苯环成属于反式肉桂酸分枝，是通过将反式肉桂酸丙基侧链的Ｃ２单元方式为Ｐ氧化，非Ｐ－氧化或两者结合的方式（Ｂｏａｔｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，２００４；０ｒｌ氧化途径己在矮牵牛花中被完全阐明，其过程类似于脂肪酸的分解过氧化物酶体（Ｋｌｅｍｐｉｅｎｅｔａｌ．，２０１２；邋Ｑｕａｌｌｅｙｅｔａｌ．，２０１２）。苯甲酸的关键中间体，经苯甲醛脱氢酶氧化生成苯甲酸（Ｌｏｎｇｅｔａｌ．２００９）苯甲醛合成的酶促反应仍然未知。苯丙素类化合物（Ｃ６－Ｃ３）如：）、异丁子香酿（ｓｉｏｅｕｇｅｎｏｌ）、甲基丁子香}（ｍｅｔｈｙｌｅｕｇｅｎｏｌ）、ｅｔｈｙｌｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）等的生物合成是反式肉桂酸生成的Ｐ－香豆酸，经柏醇，进而合成各种具有挥发性的苯丙素物质。苯丙素代谢的一些到花青素代谢和木质素代谢中，各种代谢物质相互影响，涉及多种的代谢网络（Ｂｏａｔｒｉｇｈｔ邋ｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑１邋－
（ＶａｎＭｏｅｒ－ｋｅｒｃｋｅｅｔａｌ．，邋２０１１）。Ｓｐｉｔｚｅｒ－Ｒｉｍｎ邋等人（２０１２）发现位于逦下游逡逑的五ａｓ邋／通过正向调节和花香结构基因来调控花香产物的合成，而ＯＤＯ／对逡逑五０５／具有负调控作用。调控网络如图１－２所示（Ｓｐｉｔｚｅｒ－Ｒｉｍｏｎｅｔａｌ．，２０１２）。逡逑６逡逑
异丁子香酚的苯环上可能发生进一步修饰，如甲基化、异戊烯基化或形成逡逑亚甲基桥等，如在氧位甲基转移酶（ｆｆｉＭＴ）作用下生成甲基化产物甲基丁子香酚逡逑（ｍｅｔｈｙｌｅｕｇｅｎｏｌ）或甲基异子丁香酌（ｍｅｔｈｙｌ－ｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）（见图１－１），这些修饰反逡逑应以及ＥＧＳ、ＩＧＳ对底物的竞争增加了丁子香酚代谢的复杂性。逡逑逦？邋ＢＫｉｎｔｎｃｘｄｗｏＭｌＩｎｔＣＭＩｌ逡逑／／邋Ｐｔｗｎｙｌａｉａｎｉｎ＊逦Ｃｔｎｎｗｎｔｃ邋＊ｃｔｄ逡逑Ｐｈｃｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｔｄ邋ｖｏｌａｔｉｌｅ邋（Ｃ６－Ｃ２）逡逑ｐ－Ｃｏｕ？ｎＭｔｃ邋Ｋｉｄ逦Ｖ＊ｎＵｌｔｎ邋（Ｃ６＊Ｃ１＞逡逑ｔ逦？逡逑%煎危耍湾危桑茫浚危慑义弦灰还郏樱硬峰义希穑茫浚酰恚颍铮欤茫铮铃危茫幔妫欤澹铮戾澹茫铮铃巍澹澹疲浚睿椋
本文编号：2825740
【学位单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S685.17;Q943.2
【部分图文】：
－逦引言逡逑酸解l#酶（ｐｈｂｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，邋ＰＡＬ）催化生成反式肉桂酸（ｄ，ＣＡ）。可见；ＰＡＬ与ＰＡＡＳ两种酶共同竞争底物苯丙l#酸。苯环成属于反式肉桂酸分枝，是通过将反式肉桂酸丙基侧链的Ｃ２单元方式为Ｐ氧化，非Ｐ－氧化或两者结合的方式（Ｂｏａｔｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，２００４；０ｒｌ氧化途径己在矮牵牛花中被完全阐明，其过程类似于脂肪酸的分解过氧化物酶体（Ｋｌｅｍｐｉｅｎｅｔａｌ．，２０１２；邋Ｑｕａｌｌｅｙｅｔａｌ．，２０１２）。苯甲酸的关键中间体，经苯甲醛脱氢酶氧化生成苯甲酸（Ｌｏｎｇｅｔａｌ．２００９）苯甲醛合成的酶促反应仍然未知。苯丙素类化合物（Ｃ６－Ｃ３）如：）、异丁子香酿（ｓｉｏｅｕｇｅｎｏｌ）、甲基丁子香}（ｍｅｔｈｙｌｅｕｇｅｎｏｌ）、ｅｔｈｙｌｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）等的生物合成是反式肉桂酸生成的Ｐ－香豆酸，经柏醇，进而合成各种具有挥发性的苯丙素物质。苯丙素代谢的一些到花青素代谢和木质素代谢中，各种代谢物质相互影响，涉及多种的代谢网络（Ｂｏａｔｒｉｇｈｔ邋ｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑１邋－
（ＶａｎＭｏｅｒ－ｋｅｒｃｋｅｅｔａｌ．，邋２０１１）。Ｓｐｉｔｚｅｒ－Ｒｉｍｎ邋等人（２０１２）发现位于逦下游逡逑的五ａｓ邋／通过正向调节和花香结构基因来调控花香产物的合成，而ＯＤＯ／对逡逑五０５／具有负调控作用。调控网络如图１－２所示（Ｓｐｉｔｚｅｒ－Ｒｉｍｏｎｅｔａｌ．，２０１２）。逡逑６逡逑
异丁子香酚的苯环上可能发生进一步修饰，如甲基化、异戊烯基化或形成逡逑亚甲基桥等，如在氧位甲基转移酶（ｆｆｉＭＴ）作用下生成甲基化产物甲基丁子香酚逡逑（ｍｅｔｈｙｌｅｕｇｅｎｏｌ）或甲基异子丁香酌（ｍｅｔｈｙｌ－ｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）（见图１－１），这些修饰反逡逑应以及ＥＧＳ、ＩＧＳ对底物的竞争增加了丁子香酚代谢的复杂性。逡逑逦？邋ＢＫｉｎｔｎｃｘｄｗｏＭｌＩｎｔＣＭＩｌ逡逑／／邋Ｐｔｗｎｙｌａｉａｎｉｎ＊逦Ｃｔｎｎｗｎｔｃ邋＊ｃｔｄ逡逑Ｐｈｃｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｔｄ邋ｖｏｌａｔｉｌｅ邋（Ｃ６－Ｃ２）逡逑ｐ－Ｃｏｕ？ｎＭｔｃ邋Ｋｉｄ逦Ｖ＊ｎＵｌｔｎ邋（Ｃ６＊Ｃ１＞逡逑ｔ逦？逡逑%煎危耍湾危桑茫浚危慑义弦灰还郏樱硬峰义希穑茫浚酰恚颍铮欤茫铮铃危茫幔妫欤澹铮戾澹茫铮铃巍澹澹疲浚睿椋
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