番茄表皮毛形态和内部细胞骨架排布的研究

发布时间：2020-09-25 21:03

　　 番茄(Solanum lycopersicum Mill.)是世界范围内广泛栽培的蔬菜作物,也是一种重要的经济作物。覆盖于番茄植株表面的表皮毛(trichome)作为番茄应对环境胁迫的第一道屏障,可通过空间障碍、物理诱捕和化学毒杀等方式阻碍病毒或病原菌的传播,减少和抵御昆虫对植物体的危害,增强植株对非生物逆境的抗性,对于番茄的广谱抗性具有重要作用。随着细胞生物学的发展,细胞骨架(cytoskeleton)在拟南芥表皮毛发育过程中的动态变化得到了充分的研究。KCBP(kinesin-like calmodulin-binding protein)作为中心枢纽蛋白同时结合微管(microtubules,MTs)与微丝(actin filaments,AFs),从而调控拟南芥表皮毛形态建成的关键功能已在模式植物拟南芥中揭示,但相关研究在番茄中仍鲜有报道。因此,通过细胞生物学手段研究番茄表皮毛内部细胞骨架的排布,鉴定番茄表皮毛发育过程中的关键基因,解析番茄表皮毛发育的分子机制,对于提高番茄植株的广谱抗性具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究构建了增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记微管或微丝细胞骨架的转基因材料,以及敲除SlKCBP的基因编辑材料,利用激光共聚焦显微镜观察了番茄表皮毛中细胞骨架的排布状态,并进一步研究了 SlKCBP在番茄表皮毛发育过程中的作用。主要研究结果如下:1.构建EGFP标记微管或微丝的转基因番茄材料SlTub6-EGFP和Lifeact-EGFP,并利用该材料探索利用激光共聚焦显微镜观察番茄细胞骨架的方法,成功观察到番茄表皮细胞和表皮毛内部的细胞骨架排布,为在番茄中开展细胞骨架相关研究创造了基础材料。2.观察SlTub6-EGFP、Lifeact-EGFP转基因材料的表皮毛类型和形态,结果表明标记了微管或微丝的转基因株系的表皮毛类型和形态与野生型无差异,为细胞骨架标记材料的广泛利用提供可行性依据。利用激光共聚焦显微镜观察番茄表皮毛内部的细胞骨架排布,观察到微管在表皮毛的横断面上呈环状排布,而微丝则表现为径向排布,呈束状。3.通过生物信息学方法鉴定、分析番茄中的KCBP蛋白,并进一步利用CRISPR/Cas9系统对番茄基因组进行精确编辑,敲除SlKCBP基因,获得SlKCBP-CRISPR材料。SlKCBP-CRISPR材料在表皮毛的类型及形态上与野生型无明显差异。通过杂交手段,将SlKCBP-CRISPR材料分别与SlTub6-EGFP、Lifeact-EGFP杂交,获得EGFP标记微管或微丝的SlKCBP基因编辑材料,为深入研究SlKCBP基因在细胞骨架排布中的作用奠定基础。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S641.2
【部分图文】：

逦Ｉ绪论逡逑拟南芥表皮毛的发育过程如图１．１所示，表皮毛的形态发生表现为单个表皮细胞的膨大逡逑（ｂ－１），随后膨大的表皮细胞向外延伸形成主干结构（ｂ－２），并以一种固定的方式形成３？４逡逑个分支（ｂ－３），最后主干和分支扩展（ｂ－４），顶端逐渐变尖（ａ－５），表皮毛的表面形成破逡逑璃状乳突（ｂ－６）邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）。逡逑５邋６邋媻逡逑图１．１拟南界表皮毛的扫描电镜图（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）逡逑表皮毛左边的数字表示该表皮毛的发育阶段。（ａ）比例尺＝１００邋ｐｍ。（ｂ）比例尺＝５０邋ｐｍ。逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋＼＼＼ｔ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０００）逡逑Ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｌａｂｅｌｌｅｄ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｉｔｓ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ，邋（ａ）邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋｜ｉｍ．邋（ｂ）逡逑Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋５０邋｜ｉｍ．逡逑拟南芥的表皮毛形成的分子机制已得到深入的研究，该过程受多个基因的直接调控。逡逑拟南芥表皮毛相关调控因子主要可分为两类：一类是对表皮毛形成起正向调控作用的逡逑Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ邋转录因子邋ＧＬＡＢＲＯＵＳ〗（ＧＬｌ

逦Ｉ绪论逡逑拟南芥表皮毛的发育过程如图１．１所示，表皮毛的形态发生表现为单个表皮细胞的膨大逡逑（ｂ－１），随后膨大的表皮细胞向外延伸形成主干结构（ｂ－２），并以一种固定的方式形成３？４逡逑个分支（ｂ－３），最后主干和分支扩展（ｂ－４），顶端逐渐变尖（ａ－５），表皮毛的表面形成破逡逑璃状乳突（ｂ－６）邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）。逡逑５邋６邋媻逡逑图１．１拟南界表皮毛的扫描电镜图（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉｅｔａｌ．，邋２０００）逡逑表皮毛左边的数字表示该表皮毛的发育阶段。（ａ）比例尺＝１００邋ｐｍ。（ｂ）比例尺＝５０邋ｐｍ。逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋＼＼＼ｔ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０００）逡逑Ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｌａｂｅｌｌｅｄ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｉｔｓ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ，邋（ａ）邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋｜ｉｍ．邋（ｂ）逡逑Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋５０邋｜ｉｍ．逡逑拟南芥的表皮毛形成的分子机制已得到深入的研究，该过程受多个基因的直接调控。逡逑拟南芥表皮毛相关调控因子主要可分为两类：一类是对表皮毛形成起正向调控作用的逡逑Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ邋转录因子邋ＧＬＡＢＲＯＵＳ〗（ＧＬｌ

１．１．２．１烟草表皮毛的研究进展逡逑烟草的表皮毛是一种多细胞表皮毛，根据其是否有腺体，可分为有腺体和无腺体两大逡逑类（Ａｎｄｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，１９８８），根据形态细分可分为五种类型，共９种形态（图１．３，刘金秋，逡逑２０１７）。据统计，烟草腺体毛（ｇｌａｎｄｕｌａｒｔｒｉｃｈｏｍｅ）的数量约占烟草所有表皮毛数量的８６°／0，逡逑这说明烟草腺体毛在烟草的生长发育过程中具有重要的作用。逡逑ｉｉｖｉｉｉｉＬ逡逑１２逦３逦７逦８逦ｑ逡逑注：１－２．单列保护毛；３．分叉保护毛：４－７．腺毛；８．分叉腺毛：９．短柄腺毛逡逑图１．３烟草表皮毛形态（刘金秋，２０１７）逡逑Ｆｉｇ邋１．３邋Ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ｔｏｂａｃｃｏ邋ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ邋（Ｌｉｕ，邋２０１７）逡逑烟草表皮毛与拟南芥表皮毛相比，类型更加多样，结构更加复杂。形态上的这些差异逡逑也暗示了二者表皮毛发育过程中的基因调控网络上的差异。研究表明，将金鱼草逡逑（ｄ油＞ｒ／７／ｍ洲／而力《）的Ｒ２Ｒ３邋ＭＹＢ类转录因子的调控基因ＭＬｍ和ＭＬｍＺＪ／Ｚ／转入逡逑烟草中，能够使烟草子叶、叶片和茎上的表皮毛数量明显增加（Ｐｅｒｅｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．，２００５）。逡逑而在烟草中超表达ＧＬ／基因对植株表皮毛的类型和数量均未产生影响，在拟南芥表皮毛逡逑缺失突变体发／／－／中超表达Ａ／／ＡＴ４基因也不能使其表型恢复（Ｐａｙｎｅｅｔａｌ．

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本文编号：2827067