山葡萄低温锻炼期糖代谢相关基因的表达及VvAGPS1基因的功能鉴定
发布时间：2020-09-27 06:58
我国北方冬季低温干燥使得葡萄种植需覆土越冬,这一措施加剧了生态环境恶化和导致种植成本增加,因此寻找具有抗寒性的葡萄种质资源对于我国北方地区尤为重要。本研究以抗寒性较强的山葡萄(Vitis amurensis)为试材,通过北方自然低温生长锻炼为处理,分别设定生长期(A,28±1℃)、抗寒初期(B,5±1℃)、抗寒中期(C,0±1℃)、抗寒后期(D,-5±1℃)和深休眠期(E,-10±1℃)共5个时期,测定成熟枝条中糖及其相关酶活性的变化,并对这5个时期进行了转录组测序,获得了大量的差异表达基因,对VvAGPS1基因在Micro-Tom番茄中进行功能验证。本研究获得了以下结果:(1)随着低温锻炼期温度降低,山葡萄韧皮部枝条中蔗糖和果糖的含量逐渐增加,而葡萄糖出现先增加后降低的趋势;蔗糖合成酶(SS)的活性逐渐增加;蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性在B时期则显著下降,此后直至E时期该酶活性变化不显著;酸性转化酶(AI)则在C时期有一个活性高峰,此后随着温度的降低而降低;ABA含量随着温度的降低而增加,IAA则显著下降。(2)对5个不同低温锻炼期山葡萄枝条韧皮部构建15个cDNA测序文库,共获得了69.34Gb Clean reads,各样品Clean reads均达到4.62Gb。通过设定差异基因表达阈值,筛选到了8935个差异基因,包括4064(45.48%)个上调基因和4871(54.53%)个下调基因;4个低温锻炼期与生长期相比,共有的上调基因为567个,共有的下调基因为1224个。GO富集分析发现,4个低温锻炼期与生长期相比,差异表达基因主要富集在分子功能中;除DvsA和EvsA在细胞组分中有富集项外,BvsA和CvsA中均没有。KEGG分析发现,在p-Value≤0.05水平下BvsA与CvsA中共同富集到的有淀粉和蔗糖代谢、类固醇生物合成及半胱氨酸和蛋氨酸代谢;BvsA与EvsA中共有的富集通路为氨基酸的生物合成及甘露醇代谢;CvsA与EvsA中富集共同的通路为氨基酸的生物合成及花生四烯酸代谢。对主要研究的淀粉和蔗糖代谢通路进行分析,结果共注释到了147个差异表达基因,包括73个上调基因和74个下调基因。在CvsA、DvsA和EvsA三个组合中共有的上调差异基因为29个,在4个低温处理期与生长期相比,共有的下调差异表达基因为31个。通过对转录因子分析发现,MYB的转录因子富集到的差异基因数量最多,其次是bHLH,而富集到最少的转录因子为VOZ和LFY。(3)对淀粉和蔗糖代谢通路研究发现,VvAGPS1基因随低温锻炼期温度的降低而高表达,因此我们对VvAGPS1基因进行了克隆并转化Micro-Tom番茄。VvAGPS1基因全长为2703bp,CDS区全长1584bp,总氨基酸数为518,分子式为C_(2608)H_(4130)N_(716)O_(769)S_(23),分子量为58557.20,pI为8.20。将VvAGPS1导入到番茄中,发现转基因株系株高和叶片面积均大于野生型。经6℃低温胁迫0h、12h和24h后发现,转基因番茄叶片中蔗糖含量随胁迫时间增加较野生型显著升高,葡萄糖含量在野生型番茄中随胁迫时间增加而下降,而转基因株系中则上升,且转基因株系的死细胞数量较野生型的少。POD、SOD和CAT活性在转基因和野生型番茄中均有差异,且随着胁迫时间增加,转基因株系较野生型的抗氧化酶的活性显著增加。电导率在转基因株系中比野生型低。低温胁迫后,VvAGPS1基因表达随时间增加而显著上调,SlAGB1和SlAGB3在24h低温处理下野生型番茄叶片中较转基因株系中则明显上调表达,SlBAM1和SlBAM8则主要在12h下高表达(β-淀粉酶)。这些结果进一步说明VvAGPS1在葡萄抗寒中具有重要作用。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S663.1
【部分图文】：
图 1-1 非生物胁迫下高等植物细胞中氧化物的形成（引自 Keunen E et al.，2013）Figure 1-1 The oxide generate in higher plant cells under abiotic stress甜菜碱作为植物非生物胁迫后体内代谢保护物质之一，主要是由胆碱脱choline dehydrogenase，CDH）和甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenaDH）催化的反应。Park 等[14]研究发现，将细菌的 codA 基因转入番茄叶绿体后显的提高了其在低温胁迫下的抵御能力，且光合速率也大幅增加，寿命和开花时增加。热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）作为一种胁迫响应蛋白，在正常细胞代中如蛋白质合成、定位和降解具有重要作用[15]，且在胁迫条件下能够有效维持蛋构和生物膜完整性，并帮助蛋白质重新折叠[16]。H rndahl 等[17]发现转叶绿体 HS南芥较野生型相比具有对热胁迫较高的耐受性。研究发现 sHSPs 在车前草营养器达是组成型，而愈伤组织中的 sHSPs 则在营养器官胞质中不表达[18]。sHSPs 还在物抗御低温[19]中起重要作用。
甘肃农业大学 2019 届硕士学位论文7图1-2 糖响应不同非生物胁迫下的图解（引自Smai F et al.，2016）Figure 1-2 Diagrammatic representation of solubles sugars under various abiotic stress不仅如此，可溶性糖作为重要的碳水化物，有效提高原生质浓度，降低冰点和减缓胞质溶质的过渡水解[53]。海藻糖是天然的双糖中最为稳定的一种，并且广泛分布在自然界的有机生物中[54]。在对真菌研究中表明，细胞在正常条件下其含量较为稳定，当细胞遭受渗透胁迫后则含量发生显著变化[55]。在低温条件下，海藻糖作为一种碳的储藏形式可分解为葡萄糖为真菌孢子的萌发和子实体的生长提供能量，且还作为胞质的保护剂从而有效的抵御了极端低温、辐射和干燥等胁迫环境[56]。三、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶结构在大多数植物中淀粉是源叶中主要光合产物贮藏形式。淀粉通过水解成蔗糖通常从源器官向库器官被动运输，这一转运过程中转化酶（Invertase
注：不同小写字母表示不同糖处理水平上差异显著（p ≤ 0.05）。下同Not:Different small letters means significant difference between treatments （p ≤ 0.05）. The same as below图 2-1 不同低温锻炼期山葡萄枝条中糖含量的变化Figure 2-1 Changes of sugar content in mountain grape shoots during low-temperature stages（二）不同生长锻炼期山葡萄糖代谢相关酶活性的变化通过分析不同生长锻炼期山葡萄糖代谢相关酶活性的变化发现（图 2-2），SPS 的活性在 A 时期与 B、C、D 和 E 四个时期均相比具有显著差异，而 B、C、D 和 E 时期之间无显著差异，且活性的高峰出现在 A 时期。AI 的活性高峰出现在 C 时期，在整个低温锻炼期随着温度的降低表现出先增加后降低的趋势。C 时期 AI 的活性与其余四个时期之间具有显著差异，且 D 和 E 之间有显著差异，而 A、B 和 E 这三个时期之间无显著差异。SS 的活性在整个低温锻炼期显著增加，在 E 时期最高，且 E 时期与其余四个时期之间均有显著差异，而 A、B 和 C 两两之间无显著差异，C 与 D 之间无显著差异。通过分析不同低温阶段与正常生长比较的酶活性发现（图 2-2D、E、F），SPS 的增
本文编号：2827567
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S663.1
【部分图文】：
图 1-1 非生物胁迫下高等植物细胞中氧化物的形成（引自 Keunen E et al.，2013）Figure 1-1 The oxide generate in higher plant cells under abiotic stress甜菜碱作为植物非生物胁迫后体内代谢保护物质之一，主要是由胆碱脱choline dehydrogenase，CDH）和甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenaDH）催化的反应。Park 等[14]研究发现，将细菌的 codA 基因转入番茄叶绿体后显的提高了其在低温胁迫下的抵御能力，且光合速率也大幅增加，寿命和开花时增加。热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）作为一种胁迫响应蛋白，在正常细胞代中如蛋白质合成、定位和降解具有重要作用[15]，且在胁迫条件下能够有效维持蛋构和生物膜完整性，并帮助蛋白质重新折叠[16]。H rndahl 等[17]发现转叶绿体 HS南芥较野生型相比具有对热胁迫较高的耐受性。研究发现 sHSPs 在车前草营养器达是组成型，而愈伤组织中的 sHSPs 则在营养器官胞质中不表达[18]。sHSPs 还在物抗御低温[19]中起重要作用。
甘肃农业大学 2019 届硕士学位论文7图1-2 糖响应不同非生物胁迫下的图解（引自Smai F et al.，2016）Figure 1-2 Diagrammatic representation of solubles sugars under various abiotic stress不仅如此，可溶性糖作为重要的碳水化物，有效提高原生质浓度，降低冰点和减缓胞质溶质的过渡水解[53]。海藻糖是天然的双糖中最为稳定的一种，并且广泛分布在自然界的有机生物中[54]。在对真菌研究中表明，细胞在正常条件下其含量较为稳定，当细胞遭受渗透胁迫后则含量发生显著变化[55]。在低温条件下，海藻糖作为一种碳的储藏形式可分解为葡萄糖为真菌孢子的萌发和子实体的生长提供能量，且还作为胞质的保护剂从而有效的抵御了极端低温、辐射和干燥等胁迫环境[56]。三、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶结构在大多数植物中淀粉是源叶中主要光合产物贮藏形式。淀粉通过水解成蔗糖通常从源器官向库器官被动运输，这一转运过程中转化酶（Invertase
注：不同小写字母表示不同糖处理水平上差异显著（p ≤ 0.05）。下同Not:Different small letters means significant difference between treatments （p ≤ 0.05）. The same as below图 2-1 不同低温锻炼期山葡萄枝条中糖含量的变化Figure 2-1 Changes of sugar content in mountain grape shoots during low-temperature stages（二）不同生长锻炼期山葡萄糖代谢相关酶活性的变化通过分析不同生长锻炼期山葡萄糖代谢相关酶活性的变化发现（图 2-2），SPS 的活性在 A 时期与 B、C、D 和 E 四个时期均相比具有显著差异，而 B、C、D 和 E 时期之间无显著差异，且活性的高峰出现在 A 时期。AI 的活性高峰出现在 C 时期，在整个低温锻炼期随着温度的降低表现出先增加后降低的趋势。C 时期 AI 的活性与其余四个时期之间具有显著差异，且 D 和 E 之间有显著差异，而 A、B 和 E 这三个时期之间无显著差异。SS 的活性在整个低温锻炼期显著增加，在 E 时期最高，且 E 时期与其余四个时期之间均有显著差异，而 A、B 和 C 两两之间无显著差异，C 与 D 之间无显著差异。通过分析不同低温阶段与正常生长比较的酶活性发现（图 2-2D、E、F），SPS 的增
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1 梁国平;山葡萄低温锻炼期糖代谢相关基因的表达及VvAGPS1基因的功能鉴定[D];甘肃农业大学;2019年
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