桂花WRKY3转录因子调控CCD4基因功能的验证

发布时间：2020-09-29 12:10

　　桂花(Osmanthus fragrans)又名木犀、岩桂、丹桂、九里香,系木犀科木犀属植物,原产我国,栽培历史长达两千多年,是著名的观赏花木、园林树种和芳香植物。桂花主要分为四个品种群,分别是四季桂品种群、金桂品种群、银桂品种群和丹桂品种群。前期的研究已经证明,桂花花瓣的颜色是由类胡萝卜素积累的多少造成的,花瓣中类胡萝卜素含量越高,花瓣的颜色就越深。桂花中的类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase 4,CCD4)可以裂解类胡萝卜素产生芳香物质β-紫罗兰酮。我们前期的研究证明β-紫罗兰酮是桂花花瓣中含量最高的精油成分之一。因此,OfCCD4基因是决定桂花花香和花色的一个关键基因。本课题通过分子生物学方法研究桂花花色或花香产生的机理,验证OfWRKY3转录因子对OfCCD4基因表达的调控。该研究可以丰富桂花基础理论知识,为桂花花香成分的利用、桂花的花色改良以及新品种的培育提供理论依据。主要的研究内容及实验结果如下:(1)OfWRKY3与OfCCD4在桂花花瓣中的表达模式分析以丹桂和银桂不同花期的花瓣为材料,通过RT-PCR的方法检测了2个品种不同时期花瓣中WRKY3与CCD4基因的表达量,结果表明:WRKY3与CCD4基因的表达模式基本一致。同时利用激素JA,SA和ABA分别对桂花花瓣处理0h,1h,3h,6h和9h。利用荧光定量PCR分别检测不同处理的桂花花瓣中WRKY3和CCD4基因的表达量,结果显示:WRKY3和CCD4基因表达都受激素JA,SA和ABA的诱导,这两个基因受激素诱导后的表达模式基本一致。上述结果表明,WRKY3可能参与了CCD4基因表达的调控。(2)OfWRKY3在烟草叶片中的亚细胞定位分析。构建OfWRKY3绿色荧光蛋白融合表达载体(35S-OfWRKY3-GFP),并以35S-GFP作为对照,利用PEG4000介导通过微压注射的方式转入烟草叶片原生质体中,暗环境下孵育12h,在激光共聚焦荧光显微镜下观察。结果显示:在对照组中,其GFP荧光几乎全部定位在细胞质中,而35S-OfWRKY3-GFP重组蛋白定位在细胞核中。说明WRKY3转录因子可能在细胞核中起作用参与调控了相关基因的表达。(3)构建含35S-OfWRKY3基因超表达载体和OfCCD4-GUS重组靶质粒共转化烟草检测GUS蛋白的活性。分别构建35S-OfWRKY3超表达载体和OfCCD4-GUS重组靶质粒通过微压注射的方式共转化烟草叶片,并以35S-GFP和OfCCD4-GUS重组靶质粒的共转化作为对照试验。孵育36h,通过对烟草叶片进行组织化学染色定性研究GUS的表达水平,染色结果表明:在对照叶片中基本上未见有蓝色,而OfWRKY3超表达的叶片中,沿叶脉处明显被染成蓝色,说明OfWRKY3基因的超表达促进了GUS基因的表达,OfWRKY3蛋白可以结合在OfCCD4启动子上促进GUS基因的表达。(4)OfWRKY3蛋白在桂花花瓣中的瞬时超表达分别构建35S:OfWRKY3超表达载体通过真空抽滤的方式共转入丹桂盛花期花瓣中,并以35S-GFP作为对照。黑暗环境中孵育36h,提取花瓣中的总RNA,通过荧光定量PCR检测目的基因的转录水平。结果证明,OfWRKY3转录因子超表达促进了OfCCD4基因的表达。(5)OfWRKY3蛋白的体外表达及纯化。将OfWRKY3转录因子基因序列,通过PCR扩增得到目的片段,连接入pET-30蛋白表达载体,转入大肠杆菌BL21感受态细胞中,通过IPTG诱导OfWRKY3蛋白的表达。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白,并利用His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化,获得了纯化的OfWRKY3蛋白。(6)凝胶迁移实验(EMSA)验证OfWRKY3转录因子是否能与OfCCD4基因上游的W-box序列结合。人工合成OfCCD4基因启动子的W-box元件序列,利用凝胶迁移实验验证W-box元件序列是否能够与OfWRKY3蛋白相互结合,结果显示:在同时加入OfWRKY3蛋白和W-box元件的泳道有明显的滞留条带,而同时加入蛋白、元件和竞争性探针的泳道无滞留条带出现,说明OfWRKY3蛋白在体外能够和OfCCD4基因启动子上的W-box元件相互结合。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：Q943.2;S685.13
【部分图文】：

桂中,不同时期,基因,茉莉酸

2.3.2 荧光定量 PCR 分析经激素处理后 OfWRKY3 与 OfCCD4 的表为了检测 OfWRKY3 表达量的改变是否会引起 OfCCD4 基因表达量的变化，我三个花期中的银桂和丹桂用植物激素水杨酸、茉莉酸、脱落酸处理后在 0 小、3 小时、6 小时和 9 小时时采摘花瓣进行荧光定量 PCR 检测(图 2-2)。结果茉莉酸和脱落酸处理的花瓣，OfWRKY3 的转录水平在 3 小时的时候达到最高相比分别增加了 4.3 和 3.5 倍，之后慢慢恢复到最初的水平。而经过水杨酸处其 OfWRKY3 的表达量在 6 小时时达到了最高，是起初的 2.3 倍，之后慢慢回小时时恢复到最初的水平。同时，在这三种激素处理的花瓣中 OfCCD4 基因(图 2-2)与 OfWRKY3 基本一致。

激素处理,桂中,花瓣,不同时期

花瓣其 OfWRKY3 的表达量在 6 小时时达到了最高，是起初的 2.3 倍，之后慢慢回落，在 9 小时时恢复到最初的水平。同时，在这三种激素处理的花瓣中 OfCCD4 基因的表达模式(图 2-2)与 OfWRKY3 基本一致。图 2-1. RT-PCR 对不同基因在丹桂和银桂中不同时期的表达量检测Fig 2-1. The expression profiles of different genes in different flowering stages were examined

菌液,重组质粒,烟草,分离表

常温避光静置 2 个小时。菌液，用微压注射的方式转入烟草烟草苗上取下，分离表皮细胞，经Y3-GFP 重组质粒的构建OfWRKY3的引物序列，经过PCR扩后回收，将提取的 S1300 质粒与目组质粒。将得到的重组质粒进行菌证得到的片段与预期大小相一致（M 1 2 3

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