苹果属小金海棠MxWRKY106基因的克隆与功能分析

发布时间：2020-09-30 12:06

　　 本研究以苹果铁高效砧木小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为试材,利用同源克隆的方法设计特异性引物,以克隆得到的WRKY转录因子为研究对象,提取小金海棠的RNA并将其逆转录为单链的cDNA,通过PCR扩增得到MxWRKY106基因。MxWRKY106基因开放阅读框长度为1059 bp,编码351个氨基酸,仅含有1个WRKY结构域,且锌指结构为C_2H_2型,说明其归属于WRKY家族的第Ⅱ类。利用软件MEGA 7构建MxWRKY106基因与其它物种里同源基因的系统进化树,显示MxWRKY106与苹果(Malus domestica)MdWRKY53的同源性最高。对其进行亚细胞定位后,结果显示MxWRKY106蛋白定位在细胞核中。半定量RT-PCR的结果表明,MxWRKY106基因在小金海棠不同部位中的表达具有组织特异性。在正常的Hoagland营养液培养时(0 h),MxWRKY106基因在所提取的器官中均有表达,并且在新叶和根中的表达量最大。在低温(2℃)、高盐(200 mM NaCl)、缺铁(4μM FeNa-EDTA)和铁过量(160μM FeNa-EDTA)处理下,MxWRKY106基因的表达量随处理时间的增加呈现先上升后下降的趋势。实时荧光定量PCR结果显示,在正常的Hoagland营养液培养条件下(0 h),MxWRKY106基因在不同部位的表达情况为:新叶中的表达量最高,根次之,老叶略高于韧皮。低温(2℃)、高盐(200 mM NaCl)、缺铁(4μM FeNa-EDTA)和铁过量(160μM FeNa-EDTA)处理下,在小金海棠的新叶中,MxWRKY106基因的表达量在处理后第1 h到第24 h呈现出先升高后降低的趋势,分别在低温处理3 h、高盐处理6 h、缺铁处理9 h和铁过量处理9 h时达到峰值。在小金海棠的根中,MxWRKY106基因的表达同样呈现先升后降的趋势,低温、高盐、缺铁和铁过量分别在9 h、3 h、6 h、6 h达到峰值。表达量的趋势与半定量RT-PCR的结果一致。利用农杆菌介导法将小金海棠MxWRKY106基因在拟南芥中过表达,筛选得到3个转基因株系,经盐处理7天后,野生型植株与转基因型相比表现出极为明显的黄化现象;经缺铁处理14天后,野生型拟南芥黄化矮小,根系较少,而转基因型植株生长发育正常仅少数叶片变黄;经铁过量处理14天后,野生型拟南芥叶片卷缩,叶色发紫,而转基因型植株仅老叶变黄,新叶生长正常。测定的与植物抗性相关的各项生理指标显示,在转MxWRKY106基因的拟南芥各株系中CAT、SOD、POD的活性以及脯氨酸含量较对照组均升高,MDA含量较未处理组变化不大,叶绿素含量下降,与对照组的差异显著。说明经高盐、缺铁和过量铁处理后转MxWRKY106基因拟南芥植株的受损程度减轻,对高盐、缺铁和铁过量胁迫的抗性增强。综上所述,过表达MxWRKY106基因可以增强拟南芥对高盐、缺铁和铁过量胁迫的耐受性。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S661.1
【部分图文】：

技术路线

总RNA的提取Fig.3-1ExtractionoftotalRNA

MxWRKY106基因全长的扩增

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本文编号：2830822