白灵侧耳菌丝生理成熟期环境控制及生理指标测定

发布时间：2020-10-02 06:35

　　白灵侧耳(Pleurotus tuoliensis)是我国具有自主知识产权的重要食用菌,市场潜力巨大。但白灵侧耳栽培技术还不完善,尤其是白灵侧耳菌丝生理成熟期的相关基础研究缺乏。本文针对白灵侧耳菌丝生理成熟期长和管理存在的问题,对其菌丝成熟度及过程控制进行系统研究。在此基础上,开展不同后熟温度和不同光照对三种胞外酶酶活和麦角固醇含量的影响进行分析,并运用代谢组学方法从整体上发现不同处理之间的代谢物差异,筛选相关的差异代谢产物,进一步分析差异代谢物的变化趋势,探究白灵侧耳菌丝生理成熟期生理生化变化规律,建立菌丝成熟度评价方法,为完善白灵侧耳栽培技术理论建立提供科学依据。本研究通过对菌丝生理成熟期的温度、光质的调节,然后对相应处理条件下白灵侧耳菇蕾数量、子实体形状、子实体平均产量等结果进行分析,筛选出菌丝生理成熟期管理的最佳条件。同时对不同处理下菌丝体内的麦角固醇含量和三种胞外酶酶活进行了测定,通过不同处理之间的酶活变化曲线,寻找酶活性的变化规律,确定白灵侧耳菌丝成熟度酶的参考指标。通过不同处理之间的麦角固醇变化曲线,根据麦角固醇的变化趋势,推测在菌丝生理成熟期的最佳长度。具体研究内容如下1、白灵侧耳的菌丝生理成熟期在5种不同温度控制下(17℃、20℃、23℃、26℃、29℃)培养35 d后进入出菇管理,研究结果表明温度为17℃时,白灵侧耳子实体质量、大小稳定,且出菇时间很集中,单个子实体的平均质量为201.91 g/瓶,生物学效率为70.35%,且与其它处理差异显著。在4种光照条件下(白光、红光、蓝光、黄光),蓝光产量最高,单个子实体的平均质量为182.91 g/瓶,生物学效率为63.73%,但与其它处理差异不显著。因此,可以初步确定白灵侧耳菌丝生理成熟期的最佳温度为17℃。2、对白灵菇侧耳菌丝生理成熟期5个温度下胞外酶羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶的酶活的活性变化规律进行了研究,发现羧甲基纤维素酶在第15 d达到最高值,而且不同处理间差异显著,其中菌丝生理成熟期23℃处理(处理A3)的酶活最高,为4.02 U;但第35 d时,该酶活性降低于菌丝后熟前期,且不同温度下差异不显著。淀粉酶活性在第5d左右达到最大值,其中A3处理的酶活最高,为5.83 U。半纤维素酶在菌丝成熟期活性变化很小,且温度和光照对其活性影响也不大。3、使用HPLC法对菌丝生理成熟期麦角固醇含量进行了的测定,结果表明在17℃、20℃、23℃和26℃处理时,白灵侧耳菌丝体的麦角固醇含量相对较高。温度为29℃时,麦角固醇含量相对较低,和其他实验处理差异显著;且在光色为白光、蓝光、黄光、红光的光照处理组(处理B1、处理B2、处理B3、处理B4)中,菌丝体麦角固醇含量前期无较大变化,在菌丝生理成熟期第30 d后逐渐下降,其中B2(蓝光)和B3(黄光)处理的含量最低。但在无光照条件下(处理B5),呈现相反的变化趋势,即在菌丝生理成熟期前期无较大变化,但在菌丝生理成熟期第30d后逐渐上升。在菌丝生理成熟期A1(17℃)、A2(20℃)、A3(23℃)、A4(26℃)和A5(29℃)的无光照条件下第35d麦角固醇含量达到最大,为5.13 mg/mL;在菌丝生理成熟期B1(白光)、B2(蓝光)、B3(黄光)和B4(红光)的有光照条件下则第30d麦角固醇含量达到最大,为5.73mg/mL。即有光照条件下,麦角固醇的含量会提前达到峰值,后熟周期可能可以减至30 d。4、运用气相色谱-质谱联用技术分别分析后熟0 d样品(处理C1)8个,后熟35 d、17℃(处理C2)样品8个,后熟35 d、29℃(处理C3)样品8个,进一步运用无监督的主成分分析(principle component analysis,PCA)和有监督的正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)对数据进行模式识别,分析不同处理之间的代谢产物的差异。结果表明,PCA分析结果显示不同处理之间和分析质控样本有分离趋势;OPLS-DA模型能将处理C1、处理C2和处理C3三组样本分离。筛选组间差异代谢物的标准是OPLS-DA模型第一主成分的VIP值1,t检验(Student’s t-test)返回的p值0.05。并计算出差异代谢物变化倍数FC(Fold change),共筛选出117种差异代谢物,其中有机酸、氨基酸和醇类物质的共占了总代谢物的64%,还有一些胺类、酚类、糖类和酮类物质。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S646
【部分图文】：

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图 1.1 一般的代谢组学流程图Figure 1.1 The typical workflow for metabolomics1.6.1 样品分析技术代谢组学研究分析现有技术有其自身的特点和适用范围，可以根据自身的需要和特点，选择合适的研究方法和平台，并基于此选择优化分析方法进行实验。虽然大量的分析技术被用于代谢组学研究，但是这个阶段使用的两种技术是核磁共振（NMR）技术和质谱技术。核磁共振波谱技术（Nuclear magnetic resonance,NMR），NMR 的优点是检测灵敏度稳定，对大多数的小分子代谢物都有相同的灵敏度，且 NMR 的样品无需复杂的预处理（Lindon，2008）。NMR 相对于 MS 的最大缺陷是检测小分子代谢产的灵敏度不高，难以检测到低丰度代谢产物，而且 NMR 可鉴定的代谢物数量还比较少。液相色谱质谱联用技术（LC-MS）的样品预处理比较简单而且可分析物的范围大。不过 LC-MS也有一些缺点，例如缺乏成熟完备的鉴定未知物的数据库，而对于多级质谱谱图解析需要专业的解析知识。图 1.2 为典型的 LC-MS 结构示意图。

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图 1.2 典型 LC-MS 系统结构示意图Figure 1.2 LC-MS system structure diagram气相色谱质谱联用技术（Gas chromatography coupled to mass spectrometry, GC/MS）的精准度、灵敏度以及耐用型都非常突出，所以一般用于检测挥发性物质（Almstetter，2009）。GC/MS 有完善成熟的商业质谱数据库（NIST/EPA/NIH），且 GC/MS 更多用于微生物和植物上（T'Kindt，2009）（Allwood，2009）（Koek，2006）（Garcia，2008）。在样品的预处理上，为了增加样品的挥发性，所以使用 GC/MS 平台时需要将多样品衍生化，因此 GC-MS 的样品预处理比较繁琐。NMR 的检测灵敏度一致性和样品预处理比较简单，但是灵敏度较低限制了其在生物标志物筛选研究中的应用。LC-MS 在灵敏度、重现性和可分析物范围大。GC/MS 的优点为在分辨率、灵敏度及具有商品化的 GC/MS 数据库，但是 GC/MS 的样品制备方法和适用范围限制了其在非靶标代谢物轮廓分析中的应用。不过随着高分辨质谱技术的逐渐成熟也使可分析物范围越来越大，因此 GC-MS 逐渐成为代谢组学最常用的分析手段。虽然近年来，分析技术在一定程度上满足了复杂样品的分析要求，但是没有任何一种或两种方法完全满足代谢组学对全谱分析的要求，发展更高效的分离技术和有效利用各种分离技术仍然是其未来的发展方向。

HPLC图谱,麦角固醇,标准品,硕士学位论文

业科学院硕士学位论文第三章结果与0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.005001000150020002500300035004000Y=3903.94956*X-24.0655R2=0.9999峰面积peakarea(A)浓度concentration(mg/mL)图 3.4 HPLC 麦角固醇标准曲线Figure 3.4 HPLC Standard curve of ergosterol

【参考文献】