番茄miR1916和miR396在植物响应胁迫中的作用机制

发布时间：2020-10-11 05:12

　　 基因表达的特异性调控对植物一病原物互作和抵抗逆境胁迫是至关重要的。microRNAs(miRNAs)作为一类长度在18到25个核苷酸之间的非编码小RNA分子,可以在转录后和翻译水平的过程中通过抑制靶基因的表达,参与植物体内多种生理生化反应过程。因此,揭示miRNAs在植物应答生物和非生物胁迫中的调控作用及分子机制具有重要意义。在番茄(Solanum lycopersicum)中已经发现了多种miRNAs与生物和非生物胁迫是密切相关的,其中非保守的miR1916和保守的miR396均在多种胁迫条件下作出响应,但具体的分子机制尚不明确,特别是对番茄在与晚疫病菌(Phytophthora infestans)和灰霉菌(Botryts cinerea)互作中miR1916和miR396的研究很少,且茄科植物中的抗逆作用也未得到广泛的关注。针对上述问题,本研究通过基因工程改造策略、次生代谢水平分析及基因功能鉴定等方法,系统阐释了番茄miR1916和miR396在抗逆过程中的多效调控机制。主要研究内容及结果如下:(1)通过荧光实时定量检测发现了 miR1916在番茄与晚疫病菌和灰霉菌互作中表达量变化明显,借助生物信息学方法预测到了 miR1916的靶基因STR-2、UGT、MYB12、CC-NBS-LRR、CC-NBS和HTPG,且这6个靶基因的表达均受到晚疫病菌和灰霉菌的诱导,利用 PPM-RACE 和 5'-RACE 验证了 miR1916 对STR-2、MYB12和T、YBS12 和CC-NBS-LRR的切割位点。借助过表达和沉默技术获得了转基因植株。通过观察感病表型,发现了过表达或(沉默)miR1916降低或(提高)了番茄对晚疫病菌和灰霉菌侵染的耐受性。基于分子水平和次级代谢产物检查分析确定了 miR1916调控多种靶基因的表达,证实其既可以抑制识别病原体基因CC-NBS-LRR与CC-NBS,又可以影响花青素和a-tomatine积累的相关基因 STR-2、UGT和MYB12。(2)对番茄与晚疫病菌和灰霉菌互作过程中miR396进行检测,发现了 miR396的表达量变化较明显。并通过生物信息学方法预测到miR396的靶基因GRF1、SAMT、GH和NBS-LRR,且检测到了这些靶基因在二种病原菌侵染时表达量发生改变。番茄对病原菌耐受性实验结果显示,miR396的过表达减弱了番茄对晚疫病菌和灰霉病菌的抗性,且提高了病原菌侵染时ROS的水平。对靶基因的表达量分析结果表明,miR396抑制了GRF1、SAMT、GAMT、GH和的表达,最终导致抑制下游抗病相关基因TGA1、TGA2和PR1及JA依赖的PII和II基因的表达,但却增强了内源SA含量和NPR1表达。miR396通过SA或JA信号途径负调控靶基因及其下游基因表达是影响番茄响应生物胁迫的关键。(3)利用miR1916过表达和沉默载体,获得了转基因烟草。干旱胁迫实验分析结果表明了 miR1916在烟草抗旱过程中是负调控因子,异源过表达和沉默miR1916影响了烟草靶基因HDAC和STR的表达量,及在干旱处理后的脯氨酸、可溶性糖和ROS的积累。(4)利用异源过表达miR396获得了转基因烟草,并进行了盐、干旱和冷胁迫的耐受性分析,证实了过表达miR396会抑制GRF1、GRF3、GRF7和GRF8,进而引发了渗透调节能力的增强和ROS积累的减少,从而提高了烟草的抗逆性。因此,作为正调控因子参与多种胁迫的miR396具有全局调控的特性。综上所述,本课题一方面发现感染晚疫病菌和灰霉菌的番茄与未感染番茄相比显示出miR1916和miR396表达量的降低。miR1916的过表达和沉默可以影响靶基因STR-2、CGT、MYB12、CC-NBS-LRR、CC-NBS和HTPG基因的表达,进而影响番茄对病原菌感染的抵抗。miR396通过抑制SA和JA信号的防御相关基因,作为负调控因子参与番茄防御病原菌。另一方面,通过异源转基因改变miR1916和miR396的表达可以调控相应的靶基因表达水平揭示miR1916以负向调控的方式参与烟草抗旱,而miR396以正向调控的方式参与烟草耐盐、抗旱和耐低温的过程。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S641.2
【部分图文】：

温度、激素、厌氧、干旱和生物胁迫响应有关［１５４］。虽然这些顺式作用元件的功能目前??并未验证，但可以推测ｍｉＲ３９６在逆境胁迫中的响应机制和启动子元件密不可分。ｍｉＲ３９６??在生长发育及逆境胁迫响应中的作用机制如图１．２所示。??ｎ?〇?「⑨？??：：?城脉迫?＊??Ｉ?Ｖ?｜?Ｊ?一￣卜?＼ｍｉｉ７－Ｕｋｅ）?甘露酵脉迫?＞，勢??ｐｒｉ－ｍｉＲ３９６ａ?’??－＾?？高沒龄迫?：：??ｐｒｅ－ｍｉＲ３９６ａ?Ｍ￣？?抵抗线虫生物蒭逡嘀应??Ｚ＆ｌＪ?ｊ?叶细胞增瘦?＇??／?＾?￥?ｍｉＲ３９６ａ－５ｐ?ａｎｄ?－３ｐ?／／?＿一＾?▲??［５＊?－?，?Ｉ?＼?／?叶细胞分化??挫雜＞）花发育??光响应无件ｔ?Ｐ?生??退度咕应元件□?＼＼圓一丨?堇成．吁过程ｉｆ??激素响应元件［Ｊ］?＼?１?’Ｉ?ＩＪ??厌細細ｆ?ｆ?根部生长??Ｚ１７Ｉ１?－黨－４－｜??应元件’?＿＿〇?—？?〇?神经酰肤代谢）??图１．２?ｍｉＲ３９６在生长发育及逆境胁迫响应中的作用机制??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｍｉＲ３９６?ｉｎ?ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ａｎｄ?ｓｔｒｅｓｓｅｓ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ??１．６本课题主要研究思路??番茄中ｍｉＲＮＡｓ在与病原物互作及非生物胁迫中起着关键作用。本实验室前期工作??发现，在晚疫病菌的侵染后，番茄中多种ｍｉＲＮＡｓ发生表达的改变，其中ｍｉＲ１９１６和??ｍｉＲ３９６的变化明显。二者在其他病原菌处理后和非生物胁迫条件下均能作出响应

２．３．７?Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６沉默载体的构建??（１）?Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６的序列设计??数据库ｍｉＲＢａｓｅ中呈现出的番爺ｍｉＲ１９１６与互补链二聚体结构的序列如图２．１Ａ所??示，根据人工合成ｍｉＲＮＡｓ的沉默技术原理，设计沉默序列的结构。如图２．１Ｂ所示，??Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６序列与ｍｉＲ１９１６序列完全互补，Ａｎｔｉ－ｍｉＲ１９１６＾列则改变原本ｍｉＲ１９１６??与ｍｉＲ１９１６４的错配位点，在第５和９位碱基处设计２个错配位点，其中去除Ｇ：Ｕ错配。??Ａ??Ａ?Ｃ??５’?ＡＵＵＵＣＡＣＵＵＡＧ，?ＣＡＣ?ＵＣＡＡ?３’?ｍｉＲ１９１６??ＩＩ?Ｉ?Ｉ?Ｉ！Ｉ?ＩＩ?Ｉ?！?Ｉｌｌ?Ｉ?ＩＩ?ｌ??３

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【参考文献】

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1 肖裕;栾雨时;;miR482介导的植物生物胁迫响应[J];植物生理学报;2014年06期

2 翟俊淼;栾雨时;崔娟娟;;miR396基因家族的进化及功能分析[J];植物研究;2013年04期

3 杨凤玺;余迪求;;高表达拟南芥miR396提高烟草抗旱性(英文)[J];云南植物研究;2009年05期

4 刘冬梅;杨凤玺;余迪求;;高表达miR396小分子导致拟南芥花柱头弯曲[J];云南植物研究;2009年04期

5 ;Duplication and expression analysis of multicopy miRNA gene family members in Arabidopsis and rice[J];Cell Research;2006年05期

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1 杨柳;茄子黄萎病防卫相关microRNA的鉴定及miR482、StoL13a的功能研究[D];南京农业大学;2013年

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本文编号：2836119