番茄促分裂原活化蛋白激酶SlMPK20参与调控花粉发育的分子机制研究

发布时间：2020-10-13 11:19

　　 番茄是世界上种植最广泛的蔬菜作物之一,也是研究植物生殖发育的模式植物。前人研究表明,植物花粉发育及授粉时期对外界环境极度敏感是限制番茄坐果的主要因子,因而研究花粉发育对于番茄抗性品种的选育以及栽培技术的改良具有重要意义。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在植物逆境响应与生长发育过程中发挥多种功能。然而关于它们在植物生殖生长发育过程中的功能研究涉及不多。在本实验室的前期研究中,我们分离了番茄SlMAPK家族的16个基因,初步鉴定了一批在番茄生殖发育过程中优势表达的S1MAPK基因。在本研究中,我们发现了一个植物特有的TDY MAPK,SlMPK20,专一作用于番茄减数分裂后花粉发育过程。SlMPK20在雄蕊中优势表达,在双核期花粉中表达量达到最大值。通过RANi-介导的对SlMPK20的抑制或利用CRISPR/Cas9对SlMPK20的敲除,可育花粉显著性减少或完全消失,但其对植物营养生长和雌性生殖生长都没有影响。显微观察和基因表达分析表明,SlMPK20在单核花粉发育时期发挥功能,随后我们利用转录组分析、生化分析以及分子生物学等手段研究了该基因调控番茄花粉发育的分子机制,为深入阐明番茄花粉发育的控制机理奠定了基础,并为利用遗传工程技术调控番茄育性提供了理论依据。获得的主要结果如下:(1)利用qRT-PCR技术发现SlMPK20在番茄不同组织中均有表达,在雄蕊中优势表达;同时SlMPK20在不同发育时期雄蕊中均有表达,但在单核中后期至双核期表达量最高。原位杂交分析发现在四分体至双核期的花粉囊及花粉中均能检测到SlMPK20的转录本。分离SlMPK20启动子并进行GUS染色观察发现,SlMPK20启动子在拟南芥花序中表达强烈,进一步冷冻切片观察发现SlMPK20启动子信号清楚地出现在四分体时期至双核期。通过原核诱导表达实验及Western-Blot分析发现SlMPK20能够编码一个水溶性的大约70.5 KDa的蛋白质;亚细胞定位证实该编码蛋白遍在分布于细胞核、细胞膜和细胞质中。(2)利用RNAi技术和CRISPR/Cas9敲除系统分别获得了SlMPK20下调表达与特异敲除的番茄“Micro-Tom”转基因株系。观察发现抑制SlMPK20表达可导致约有80%的花粉败育,SlMPK20的敲除导致花粉粒几乎完全败育,同时发现SlMPK20的过表达植株生长与发育无异常;将野生型花粉授在CR-SlMPK20以及RNAi-SlMPK20转基因植株柱头上,转基因植株能够正常坐果与结籽,且种子能正常萌发,表明SlMPK20的抑制或敲除对植株营养生长与雌性生殖生长并无明显影响,SlMPK20专一地作用于番茄雄性生殖发育过程中。细胞学观察以及DAPI染色均发现SlMPK20抑制或敲除转基因植株的花粉粒败育发生在从单核小孢子向双核小孢子转变的过程中。CR-SlMPK20转基因植株花粉粒在花粉小孢子母细胞时期至单核早期均发育正常,但在单核中期开始高度液泡化,且在单核后期加剧,至双核期大部分细胞质与细胞核降解,直至成熟期花粉内含物完全降解,花粉粒坍塌皱缩。(3)利用RNA-seq技术比较CR-SlMPK20、RNAi-SlMPK20转基因植株与野生型植株雄蕊在不同发育时期基因表达的变化。转录组测序数据表明,与野生型相比,在四分体时期至单核早期(花粉败育之前),敲除SlMPK20使大量控制糖代谢和糖运输的基因以及生长素(IAA)植物激素信号传导基因显著下降;同样,在花粉败育显现的单核中后期,下调或敲除SlMPK20导致大量参与糖代谢与糖信号转导、植物激素(IAA和JA)合成和信号转导的基因发生显著性变化。然而生化分析表明蔗糖含量在四分体至单核早期、单核中后期均显著上调,内源激素IAA与JA在单核中后期与双核期均显著性下降。所以,下调或敲除SlMPK20可能从转录水平上调控糖代谢与激素信号相关基因的表达水平从而诱发番茄花粉败育。(4)酵母双杂交及双分子荧光互补实验证明了 SlMKK4与SlMPK20,SlMPK20与SlMYB32蛋白之间存在互作。且SlMPK20能够被SlMKK4体外磷酸化。由此提出一条新的在植物花粉发育过程中发挥重要作用的MAPK级联途径:SlMKK4-SlMPK20-SlMYB32。蛋白定量组学分析结果与转录组测序分析结果相符,碳水化合物代谢酶在SlMPK20调控番茄减数分裂后花粉发育中发挥重要作用。SlMPK20可能通过改变SlMYB32的磷酸化水平进而调控花粉糖代谢和糖信号相关基因、植物激素合成及信号传导相关基因的转录水平和蛋白水平,从而调控番茄减数分裂后花粉发育进程。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S641.2
【部分图文】：

浙江大学博士学位论文?１文献综述：高等植物ＭＡＰＫｓ功能与花粉发育研宄进展??子母细胞分化并经过两轮的减数分裂后（ｍｅｉｏｓｉｓ）形成四分体，随着胼胝质的降解，??小孢子从四分体中游离出来的过程；雄配子发生期（ｍｉｃｒｏｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）即自由小??孢子减数分裂后的发育形成成熟花粉的过程（ｐｏｓｔ－ｍｅｉｏｓｉｓ）?（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ，?１９８９；??Ｙａｍａｍｏｔｏ?ｅｔ?ａｌ．，?２００３；?Ｄｕｒｂａｒｒｙ?ｅｔ?ａｉ，?２００５；?Ｗｉｌｓｏｎ?ａｎｄ?Ｚｈａｎｇ，?２００９；?Ｄｅｖｅｓｈｗａｒ?ｅｔ?ａｉ，??２０１１；Ｔｗｅｌｌ，２０１１；?Ｃｈｅｕｎｅｔ?ａｌ．，?２０１３．??

??＾?ｌｉｒａｎａｉｕｒｅ?ｐｏｌｌｅｎ?ｇｒａｉｎ??嫌??图１．丨多数被子植物典型的小孢子发育过程（改自Ｍｃｘｏｒｍｋｋ?１９９３）?？??Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｏｇｅｎｃｓｉｓ?ｔｙｐｉｃａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｉｎ?ｍｏｓｔ?ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ?（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ??ｆｒｏｍ?Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ，?１９９３）．??在开花植物中，雄配子发生期被严格的定义为减数分裂后的花粉发育时期，游??离小孢子发育并经过一次或两次有丝分裂（ｍｉｔｏｓｉｓ）产生具有营养核和生殖核的成??熟花粉粒（Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ，２００４）。这一过程是通过一系列复杂的步骤进行的，己有研究??报道包括番茄在内许多物种在细胞学水平上的进展。然而，减数分裂后花粉发育的??分子机理在很大程度上仍是未知的。??在番茄花药小孢子发育的过程中

植物有丝分裂蛋白激酶（ＭＡＰＫ）级联途径参与调控病原相关分子模式（ＰＡ相关分子模式（ＭＡＭＰ）和损伤相关分子模式（ＤＡＭＰ）（引自Ｍｅｎｇ?ａｎｄ１．４?Ｐｌａｎｔ?ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?（ＭＡＰＫ）?ｃａｓｃａｄｅｓ?ｉｎ?ｓｅｎ／ｍｉｃｒｏｂｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｐａｔｔｅｒｎ?（ＰＡＭＰ／ＭＡＭＰ）?ａｎｄ?ｄａｍａｇｅ－ａｓｌａｒ?ｐａｔｔｅｒｎ?（ＤＡＭＰ）?（Ｍｅｎｊ＊?ａｎｄ?Ｚｈａｎｇ，?２０１３）．??中，ＶＷ／欠和能够被烟草花叶病毒（ＴＭＶ）激活。基于病毒基因沉默技术，研究发现ＭＡＰＫＫＫａ－ＮｔＭＥＫ２－ＳＩＰＫ／ＷＩＰＫ－ＷＲＫ导的超敏反应的ＭＡＰＫ级联途径之一（Ｊｉｎ?ｅｗ／．，?２００３）。??■Ｓ／ＭＡＰ／Ｇ、Ｓ／ＭＡＰ尺２和Ｓ／Ｍ４／火３在植物防御生物胁迫中的作用报道（Ｋａｎｄｏｔｈ?ｅｆ?？／．，２００７；?Ｍａｙｒｏｓｅ?ｅｆ?ａ／．，２００４；?Ｓｔｕｌｅｍｅｉｊｅｒ?ｅｆ?ａ／．，

本文编号：2839101