洋葱细胞质雄性不育相关基因AcAMS的克隆及其功能分析

发布时间：2020-10-18 15:00

　　 洋葱(Allium cepa L.)是百合科葱属二年生草本植物,属于异花授粉作物,是当前我国主栽蔬菜之一,种植面积广泛。洋葱杂种优势明显,但其花器小,花期不集中,单花结籽率低,人工去雄成本高、难度大,因此洋葱雄性不育系的选育和利用极为必要。目前有关洋葱细胞质雄性不育的研究,多集中于细胞质雄性不育相关候选基因的筛选及分子标记,其不育性的发生机理和调控机制暂未明确。本实验室在前期工作中,明确了洋葱发生细胞质雄性不育的原因是绒毡层细胞的提早解离,绒毡层发育相关基因AMS(ABORTED MICROSPORES)在雄性不育系与保持系中表达量差异显著。为了进一步探讨该基因在洋葱细胞质雄性不育发生中的功能,本研究克隆了AcAMS基因,分析其在花发育中表达量的差异,进行基因的亚细胞定位,构建AcAMS表达载体,转化拟南芥,检测上下游基因表达量变化,初步探讨了AcAMS与洋葱细胞质雄性不育的关系,同时构建了基于TRV的pTRV2-AcPDS载体,试图建立洋葱VIGS的体系。试验结果如下:(1)以洋葱保持系SB2四分体发育时期的花药cDNA为模板克隆了AcAMS(KY296301)基因,该基因CDS序列全长1458 bp,推测编码485个氨基酸,通过BLASTp比对发现AcAMS与AoAMS(Asparagus officinalis L.),MaAMS(Musa acuminata subsp.malaccensis),PdAMS(Phoenix dactylifera L.),EgAMS(Elaeis guineensis)的同源性均大于50%,进化树分析显示,AcAMS与石刁柏的AoAMS在同一分枝上,亲缘关系最近。经与其他物种的AMS氨基酸序列多重比对分析发现AcAMS存在bHLH(basic helix-loop-helix)结构域,属于MYC类亚家族bHLH转录因子。(2)利用实时荧光定量PCR技术,分析AcAMS基因的时空表达,结果表明AcAMS在花药中表达量最高,在其他花器官中几乎不表达,具有组织特异性,并且比较其在不育系SA2及其保持系SB2不同发育时期花药中的表达差异,发现AcAMS在花粉母细胞时期及四分体时期表达差异显著。(3)构建pGFP-AcAMS载体,采用PEG-Ga~(2+)介导法转化拟南芥原生质体,结果验证了该融合蛋白瞬时定位在细胞核内,与其转录因子核定位特性相同。(4)构建AcAMS的表达载体p1250-3301-AcAMS,利用花序侵染法遗传转化哥伦比亚野生型拟南芥,经PPT抗性筛选及PCR鉴定后获得T1代植株,与野生型相比,转基因株系表现为部分不育或完全不育,部分不育植株果荚短小,完全不育植株果荚极其短小且弯曲生长,转基因株系花的雄蕊及雌蕊更长,花药颜色黯淡且干瘪,有活力的花粉粒明显少于野生型。检测转基因株系中AtAMS及其上下游基因表达量的变化,结果显示AtAMS显著上调,AtTDF1、AtMS188显著下调,而AtMGT5表达水平无明显差异。同样方法遗传转化ams突变体拟南芥,筛选出抗性苗。(5)构建AcAMS CRISPR/Cas9基因编辑敲除载体pHUN411-AcAMS,未来将用于洋葱遗传转化。(6)以洋葱的AcPDS部分序列(333 bp)和AcAMS部分序列(384 bp),构建基因沉默载体pTRV2-AcPDS、pTRV2-AcAMS,拟建立洋葱VIGS转化体系。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S633.2
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 研究目的与意义
    1.2 国内外研究进展
        1.2.1 植物雄性不育的类型
        1.2.2 洋葱雄性不育的研究进展
        1.2.3 AMS基因的结构与功能
    1.3 技术路线
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 细菌菌株与质粒载体
        2.1.3 主要试剂与仪器
        2.1.4 引物
    2.2 试验方法
        2.2.1 AcAMS基因的克隆
        2.2.2 AcAMS生物信息学分析
        2.2.3 AcAMS基因的表达模式分析
        2.2.4 亚细胞定位
        2.2.5 植物表达载体的构建
        2.2.6 遗传转化
        2.2.7 转基因拟南芥株系及ams突变体的表型分析
        2.2.8 与绒毡层发育相关基因表达模式分析
        2.2.9 CRISPR/Cas9编辑洋葱AcAMS
        2.2.10 病毒诱导洋葱内源基因沉默的初步研究
3 结果与分析
    3.1 AcAMS基因的克隆及生物信息学分析
        3.1.1 AcAMS基因全长的克隆
        3.1.2 AcAMS理化性质分析及结构预测
        3.1.3 AcAMS与其他AMS的同源性比对
        3.1.4 AMS进化树分析
    3.2 AcAMS的基因表达模式分析
    3.3 亚细胞定位
        3.3.1 瞬时表达载体的构建
        3.3.2 亚细胞定位
    3.4 植物表达载体的构建及功能分析
        3.4.1 过表达载体的构建
        3.4.2 重组质粒转化农杆菌
        3.4.3 转基因阳性植株的筛选鉴定
        3.4.4 AcAMS功能分析
    3.5 CRISPR/Cas9编辑洋葱AcAMS
        3.5.1 洋葱基因组DNA的PCR及引物设计
        3.5.2 CRISPR/Cas9敲除载体的构建
        3.5.3 pHUN411-AcAMS转化农杆菌
    3.6 洋葱病毒诱导基因沉默体系的初步探索
        3.6.1 洋葱AcPDS与AcAMS部分片段的克隆及载体构建
        3.6.2 pTRV2-AcPDS、pTRV2-AcAMS转化农杆菌
4 讨论
    4.1 AcAMS亚细胞定位分析
    4.2 AcAMS基因表达模式分析
    4.3 AcAMS与洋葱细胞质雄性不育
    4.4 洋葱VIGS体系的建立
    4.5 下一步工作计划
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文

【相似文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 袁巧玲;洋葱细胞质雄性不育相关基因AcAMS的克隆及其功能分析[D];东北农业大学;2019年

本文编号：2846450