石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris)为东亚特有的多年生球根花卉,具有重要的观赏、药用及生态价值。中国是石蒜属植物的主要分布产地,其中又以占据了全国80%以上种质的浙江、江苏省等,为石蒜属植物种质资源的多样化分布中心。石蒜属植物花色丰富、花型独特,已逐渐成为了优良的鲜切花、盆花及园林景观配置材料。然而由于受到幼年生长期长、自然繁殖率低的限制,自然繁殖方式已不能满足持续增长的鳞茎需求量,并且大规模的鳞茎采挖,已经对石蒜属植物野生资源造成了严重破坏,高效人工繁育体系的建立迫在眉睫。本研究以目前园林应用广泛的两种石蒜属植物:换锦花(Lycoris sprengeri,Ls)及忽地笑(Lycoris aurea,La)为研究材料,基于气培条件下的鳞茎块繁殖法,从形态学、细胞学、亚细胞学、生理水平上对石蒜属植物的小鳞茎发生及发育过程展开比较研究。首次在石蒜属植物研究中结合PacbioIso-seq和Illumina RNA-seq进行联合测序,构建了石蒜属植物全长参考转录组及小鳞茎发生及发育相关基因池数据库,并基于该平台系统地进行了种间及种内两种比较模式下的差异表达基因筛选及功能分析,初步揭示了创伤诱导的乙烯生物合成及其信号传导与小鳞茎发生能力间的相关性,将研究目标聚焦在基盘切割造成的创伤刺激引起的乙烯生物合成及其信号传导、植物创伤响应反应与创伤诱导的植物再生关系中。本研究为进一步解析石蒜属植物小鳞茎发生及发育的分子机理,以及有效推动原产于我国的野生球根花卉的人工繁育体系构建及种球商品化育种的实现具有重要意义。主要研究结果概括如下:1.气培条件下石蒜属植物小鱗茎发生及发育阶段确定为了探究在自然条件下的石蒜属植物小鳞茎发生及发育过程,在不添加外源植物生长调节剂的情况下,通过基盘切割处理诱导小鳞茎发生的方式建立了气培小鳞茎发生及发育研究体系,并从形态学、组织学、亚细胞学、生理水平等层面展开种间对比研究,首次将气培条件下的石蒜属植物小鳞茎发生及发育过程划分为四个主要阶段:(1)早期感受阶段(0-3d),(2)腋芽萌发及伸长阶段(3-9d),(3)小鳞茎形成阶段(9-15d),(4)小鳞茎发育及膨大阶段(15-45d)。并基于再生小鳞茎数量统计分析,将两者分别定义为高增殖率表型(Ls)和低增殖率表型(La)。同时,经由该体系确定的小鳞茎发生方式、发生组织部位以及发生关键时期,为后续转录组测序取样点的选择提供了充分的数据支持。2.基于“腋芽起源”的小鱗茎发生方式确定本研究基于气培体系证实了石蒜属植物小鳞茎的腋芽发育起源方式。并基于小鳞茎于鳞片远轴端连接基盘处组织发生的特点,揭示了基盘结构在这一过程中的必要性。同时,气培体系还揭示了石蒜属植物“由顶向基”的小鳞茎发生方式,即由内层鳞片向外层鳞片发生;亚细胞学分析进一步揭示了淀粉粒在这一过程中的旺盛代谢活动,表明在受到基盘切割刺激后,细胞中淀粉代谢响应的迅速性,也首次将球根花卉小鳞茎发生及发育这一生物学过程的研究聚焦到发生前期无肉眼可见形态变化的感受态阶段(0～6h)。3.联合测序构建石蒜属植物全长参考转录组基于建立的气培发生研究体系和划分的四个主要生长阶段,对两个种的小鳞茎发生及发育过程进行了时间序列的对比取样(Oh,6h,48h,6d,15d,27d,36 d),在石蒜属植物研究中首次结合Pacbio Iso-seq及Illumina RNA-seq开展双平台联合测序,通过分平台测序并整合两平台测序结果,构建获得了石蒜属植物的全长参考转录组。利用Illumina HiSeq Xten转录组测序平台完成了换锦花及忽地笑两个种7个时期共计42个样品的测序,共得到352.12Gb原始下机数据(Clean Data)。经过进一步质控后共获得Final cleaned reads换锦花为486,423,193条,忽地笑为526,792,197条。其中,换锦花的Final cleaned reads被进一步用于校正Pacbio Iso-seq数据中的低质量序列,该平台共获得转录本序列258,031条。七个均匀选自小鳞茎发生及发育阶段的样品等量混合后于Pacbio RS II平台进行全长转录组测序,获得Clean data共计10.39 Gb。其中低质量序列经由Illumina clean reads进一步校正,联合高质量序列共同去冗余后获得全长转录本序列37,518条。经过两平台数据整合及质控后,获得最终Finaltranscriptome assembly包含全长转录本序列285,128条,预测基因数量为204,933个。以构建的“参考转录组”为参,获得Illumina平台所得Clean reads的比对率分别为76.75%(换锦花)和68.35%(忽地笑)。共鉴定获得转录因子及转录调节子分别为4,074个及1,262个。通过与多个蛋白数据库比对,及GO和KO注释,获得了全长转录本的基因注释结果。4.石蒜属植物小鳞茎发生及发育过程中的比较转录组数据分析本研究采用ImpulseDE2方法分别获得种间差异表达基因(Differentially expressed gene,DEG)112,779个(Lavs Ls),种内DEG为换锦花67,973个,忽地笑36,251个。全局热图分析揭示了基盘切割处理后6h基因表达的显著性差异,表明转录水平的调控和种间差异的发生远早于形态变化的出现,其中6 h瞬时上调表达基因在换锦花中占比最大,而瞬时下调表达基因则是忽地笑中占比最大的部分。KEGG富集分析获得的与乙烯生物合成密切相关的代谢途径、氨基酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢在两种中表现出基因表达模式的显著差异,初步揭示了高增殖率表型与活跃乙烯生物合成的密切相关性,并首次提出了创伤诱导的内源乙烯合成在石蒜属植物小鳞茎发生及发育过程中的重要作用。(1)小鳞茎发生促进型中活跃的乙烯生物合成及信号传导本研究首次提出了应对基盘切割的活跃的乙烯生物合成及信号传导与石蒜属植物小鳞茎发生能力紧密相关。种间表达量对比分析揭示了乙烯生物合成及信号传导路径关键基因ACO,ACS,ERS1,ERS2,ETRI,ETR2,EIN4,CTR1,-EIN2,EIN3/EIF1在高增殖率表型(Ls)中的显著上调表达模式,表明活跃的乙烯合成可能对创伤诱导的小鳞茎发生具有一定促进作用。并基于乙烯的创伤响应性,通过分析创伤响应相关基因进一步揭示了快速的创伤响应能力与小鳞茎发生能力间的相关性;(2)基盘切割的双重作用不同于传统研究中基盘切割破坏顶芽,从而促进腋芽萌发的研究方向,本研究基于创伤响应相关基因ANAC071、RAP2.6L、ACS2、LOX2等在高增殖率表型(Ls)中的快速响应性,揭示了基盘切割在石蒜属植物小鳞茎发生及发育过程中的“双重作用”:一方面基盘切割消除了鳞茎内部的顶端优势,通过调控生长素转运促进小鳞茎(腋芽)萌发;另一方面基盘切割造成的创伤可能作为一种信号启动并促进了小鳞茎(腋芽)发生。同时,占比最高的转录因子(TF)和转录调节子(TR)家族的ERF和AUX/IAA共同揭示了乙烯和生长素在石蒜属植物小鳞茎发生及发育过程中的关键参与性,并提出生长素对小鳞茎发生的调控可能经由响应生长素而产生的乙烯介导,而作为一种防御性响应激素,乙烯的合成又对生长素转运产生影响,二者相互作用,共同参与调控石蒜属植物小鳞茎的发生及发育。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S682.2
【部分图文】：
我国石蒜属植物资源丰富，但其基本上都处于野生状态。并且，随着近年来??园林景观及药物研发的大量需求，石蒜属植物鱗茎的人工采挖量不断增加，然而??由于受到自然繁殖条件下增殖系数低、鱗茎发育周期长等因素的限制（图１．１），??自然繁殖方法已无法满足日益增长的鱗茎需求量，这不仅阻碍了石蒜属植物的进??一步广泛应用及资源开发，还导致了其野生鳞茎资源数量的显著下降，并且这已??经对石蒜属植物的资源保护构成了明显威胁（常乐等，２０１１）。同时，石蒜属植??物的这一生长特点也是长期以来制约该属植物人工繁育、新品种培育以及种球产??业化繁育的限制因素（常乐，２０１１；余琳芳，２０１４）。??目前，石蒜属植物的研究主要集中于组织培养（林田，２００６；吕玉华，２００５；??龙祥友，２００９；巩檑，２０１２；余琳芳，２０１４；刘旭析，２０１５）、核型分析（邵建??章等，１９９４；任秀芳等，１９９５；余本棋等，２００４；余本褀
２００７；巩檑，２０１２），吟片（Ｂｌｏｍｅｒｕｓａｎｄ?Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，?２００２；?Ｂａｃｃｈｅｔｔａ，ｅｔａｌ．，??２００３；时剑，２０１１），和各类花器官（Ｚ：ｉｖａｎｄＬｉｌｉｅｎ－Ｋｉｐｎｉｓ，２０００；刘雅莉，２００４；??佘琳芳，２０１４）等。根据发育过程分类（图１．２），组织培养可划分为直接形态??发生（Ｄｉｒｅｃｔ?ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ?）和间接形态发生（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ?ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ?）两种类型。??其中，直接形态发生包括通过外植体中已经存在的腋生分生组织的发育，不定分??生组织犮生或体细胞胚胎发生途径形成新个体。而上述发育方式中的后两种又可??以通过先形成愈伤组织，后经愈伤组织分化再形成不定分生组织或体细胞胚胎，??４??
１．２石蒜属植物繁育现状??１．２．１石蒜属植物自然繁殖??石蒜属植物在自然条件下一般以分球繁殖为主（图１．３），由于鱗茎中心顶??芽结构的存在，顶端优势作用显著，腋芽形成受到抑制，只有当成熟鱗茎进入生??殖生长期，分化形成的花芽抑制了顶端优势作用时，鱗茎才具有分球能力，从而??萌发形成腋芽（陈泓伟，２００７）。并且石蒜属植物繁殖系数较低，自然分球率仅??有１．８倍（吕美丽等，１９８８），其中根据种类的不同，每年分生１？２个子鳞茎不??等，子鱗茎生长为成熟开花鱗茎还需要经历３？４年。若以种子繁殖则历时更长，??需要进行４？５年的营养生长（吕玉华
【参考文献】
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本文编号：
2849488
