芸薹根肿菌近红外光谱检测体系及喜树碱抑菌机理的研究

发布时间：2020-10-22 00:21

　　 十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一种重要土传病害。该病害在全世界不同国家广泛分布,严重威胁十字花科作物产量和产品质量。由于根肿菌休眠孢子具有较强的生命力,在土壤中可以存活15年之久,一旦发病难以根治。因此,根肿病的早期检测对防控该病十分重要。为此,本研究在采用常规方法与分子生物学方法检测根肿病菌的基础上,探索了利用近红外光谱根肿病菌的技术体系,旨在将这一新技术用于根肿菌的检测。同时,本论文结合相关工作基础,研究了生物抗菌剂喜树碱(Camptothecin,CPT)对水稻褐条菌的抑菌机理。研究取得了如下主要结果:1.分别从湖北省长阳县发病田间采集大白菜根肿标样,在温室内人工接种“凱选优”上海青不同时间段幼苗,从标样中分离提取的病菌休眠孢子,制备成孢子悬浮液,经不同方法处理,进行显微镜观察。结果显示,在光学显微镜下可清晰观察到根组织内休眠孢子的形态(近圆形)、大小(2μm~3μm)。不同发育阶段感病幼苗的根毛中根肿菌出现不同形态,包括初级游动孢子(2 d苗)、初级原生质团(2 d~4 d苗)和游动孢子囊(8 d幼苗))和游离的休眠孢子。这种方法简便、快速、经济,对根肿菌侵染寄主的早期检测较为适用。2.通过对比分析不同DNA提取方法(CTAB提取法和醋酸钾提取法),以及对常规PCR方法的反应条件和引物进行筛选,进一步对常规PCR检测根肿菌方法进行了优化,筛选出可检测最低模板DNA浓度为10-4 ng/μL的根肿菌PCR检测方法。采用该方法对不同地区的4种十字花科作物品种、室内菌土接种的12种十字花科作物幼苗及土壤中含根肿菌的进行PCR检测,证明该方法检测效果良好。3.分别以早期油菜幼苗的根(叶)部组织为试验对象,探索了基于近红外光谱分析的新型根肿菌侵染分析与检测方法。基于导光谱和主成分分析等技术对近红外光谱数据进行分析,发现在1阶导和2阶导光谱的主成分特征空间中包含着鉴别根肿菌侵染的有效信息。并采用支持向量机对这些有效信息进行检测分析,在根组织的近红外光谱特征和多维特征中,当Sigma取0.4值时,0阶和2阶导光谱组合检测率最高,可达99.71%;而在叶组织的近红外光谱特征上,当Sigma取3.5~4.0值时,0阶和1阶导光谱组合检测率最高,可达99.28%。上述研究结果为十字花科作物根肿菌的早期监测、病原学深入研究和病害早期防控有应用价值。4.研究了喜树碱(CPT)对水稻褐条菌Aaa RS-2菌株的抑菌活性。发现浓度为0.5 mg/mL的CPT(pH 7.5,8 h)对Aaa RS-2菌株具有明显的抑菌作用,抑制率最高可达73.9%。通过游动性试验、活/死细胞染色、扫描电镜观察、血清学试验、分泌系统和拓扑异构酶相关基因差异性表达分析试验,进一步验证了CPT对该菌株的抑菌作用。差异性表达分析试验结果显示拓扑酶相关基因gyrB和分泌相关基因porin呈明显的差异表达。这些结果对揭示CPT对Aaa RS-2的抑菌机理提供了新的信息。上述结果扩展了CPT的抑菌谱,为利用这一生物杀菌剂防治水稻褐条菌提供了理论依据。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S436.341;S435.654;S435.11
【部分图文】：

末期，植株会严重的脱水、萎蔫，甚至凋亡。这个阶段植株间和阴雨恢复正常（司军 2001）。物的地上症状，是随着作物品种不同而有所区别的。感病大白少，不易成球。菜苔等作物感病后，植株随着病情发展，叶片坏死甚至最终脱落。花椰菜等，感病植株的花球重量减轻且品 al 2004）。而株型较大的十字花科作物，如油菜、抱子甘蓝等，伏，且感病油菜的种子数量和含油量明显下降（Tewari et t al 2006, 2007; Cao et al 2009; Peng et al 2011; Hwang et d Hwang 2013）。根组织作为植株的代谢库在被根肿菌感染后会芽中掠取大量的营养物质导致植株不能维持其正常生长发育根部出现不同的病害症状（Ludwig-Müller et al 2009a）。

根肿病最显著的症状主要是在根部。根肿菌侵染寄主后，其根部激素分泌会一系列的变化，这导致了根系部分薄壁细胞的大量增大和增生，进而形成肿肿瘤的大小、形状、数量，以及所发生的部位因寄主不同而有所不同（赖传2008），总体来说可以大致分为两大类：1）根系比较发达的十字花科作物，菜、甘蓝、油菜和芥菜等，其主根和侧根上均会有肿瘤发生，但大小不一也不同。主根上的肿瘤表现为体积大却数量少，而侧根则是体积小但数量多根类蔬菜如萝卜、芜菁等，肿瘤则大多发生在侧根上，偶尔也在根端发生，根一般无明显变化。肿瘤的形状也是多种多样，从纺锤形、手指形到不规则，且大小各异，小的如绿豆，大的如鸡蛋甚至更大。十字花科作物的根部肿早期表现为表面光滑，末期球形肿瘤的表面裂开，时常由于其他细菌的侵入现腐烂（许志刚 2000；宋元林等 1995）。

图 1-3 感病萝卜地下症状（湖北省长阳植保站提供，2012）a. 鼠尾状的感病萝卜；b. 缢缩变黑的感病萝卜。Fig.1-3 Different clubroot symptoms of turnip with P. brassicae infected.a. Rat-tailed turnip; b. Constricted and blacken turnip.2 根肿病病原学研究2.1 寄主范围在 378 个属，多达 3710 个种的十字花科作物中几乎均是根肿菌的潜在寄主，在这些寄主中可以完成病原菌生活史中的根毛侵染和皮层侵染 2 个阶段（Kageyama andAsano 2009）。目前根肿菌研究主要集中在芸薹属、萝卜属和拟南芥属等寄主，而其他属的
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本文编号：2850808