森林草莓可变剪切基因挖掘与基因组重注释研究

发布时间：2020-10-23 19:07

　　 栽培草莓(Fragaria xananassa)属于多年生草本植物,因果实营养丰富,色泽鲜艳,深受消费者青睐。草莓果实属于假果,鲜嫩多汁的果肉来自于花托,而覆盖在花托表面的瘦果才是植物学意义上的果实。与其它蔷薇科植物如苹果和桃不同,草莓是非呼吸跃变型果实。栽培草莓是八倍体(2n=8 ×=56),来自4个不同的二倍体祖先种,因此其基因组非常复杂。二倍体森林草莓Fragaria vesca(F.vesca)是栽培草莓的祖先种之一,在北半球分布最广。森林草莓基因组(～240Mb)相对较小、植株矮小、生命周期短、能够进行高效的遗传转化,是研究栽培草莓和非呼吸跃变型果实的模式材料。本研究利用二代Illumina和三代SMRT测序技术,系统挖掘了森林草莓中的可变剪切基因,分析了草莓花与果实发育过程中可变剪切的动态变化,并对两个版本的森林草莓基因组进行了重注释,显著提升了森林草莓基因组注释的准确度和完整度。主要结果如下:1.在可变剪切分析中,三代比二代测序技术具有显著的优越性本研究采用PacBio公司的单分子实时测序技术(SMRT)及Illumina二代测序技术对森林草莓果实(花托)的可变剪切进行了系统挖掘和比较。通过SMRT鉴定到33,236个全长转录本,覆盖草莓基因组v2.0.a1中的10,957个基因。我们发现虽然SMRT的测序深度比Illumina低,但SMRT可检测到57.67%的多外显子基因发生可变剪切,而Illumina只检测到33.48%的多外显子基因发生可变剪切,说明SMRT能更有效地鉴定可变剪切。2.森林草莓可变剪切图谱的建立和果实发育过程中可变剪切的变化为了挖掘草莓果实发育过程中的可变剪切,收集先前的74个转录组数据,包括果实早期五个发育阶段的不同部分,总数据量达到19亿个读段。通过分析发现共有66.43%的多外显子基因发生可变剪切,其中内含子保留(IR)占比最高,随后分别为可变受体(AA)、可变供体(AD)和外显子跳跃(ES)。此外,还发现有2,453个基因由于可变剪切导致结构域的获得或缺失。通过挖掘果实发育过程中可变剪切的变化,发现草莓受精后的果实与受精前相比,内含子保留(IR)显著降低,而可变受体(AA)显著增加。KEGG富集分析表明IR显著降低的基因中剪切体途径基因显著富集,GO富集分析表明这些基因中一些重要的代谢基因显著富集。此外,这些富集基因在果实发育第一阶段的表达水平较高,从第二时期开始即大幅度降低,表明IR这种剪切方式可能是授粉受精后果实起始的重要调控机制。3.森林草莓V2基因组重注释在转录组数据分析中,发现森林草莓基因组注释准确性差,而且只包含了蛋白编码基因的编码序列。为了提高森林草莓基因组的注释质量,优化了基因组注释流程,结合PacBio全长转录组和RNA-seq数据,使用MAKER2,AUGUSTUS和PASA等软件进行基因组注释,同时利用Apollo进行人工校正。我们首先对森林草莓V2基因组进行重注释,新注释被命名为v2.0.a2。在新版注释中,被调整或新增的基因有13,168个,7,370个基因具有可变剪切转录本,18,641个基因的5'和/或3'端具有UTR。BUSCO值由88.9%增加到95.7%。此外,增加了 1,938个lncRNA,171 个 miRNA 和 51,714 个小 RNA 簇。4.森林草莓V4基因组重注释2018年,森林草莓V4基因组面世,因采用PacBio SMRT测序数据进行组装,其组装质量大幅度提高,与V2相比增加了 24.96Mb序列,基因数目却减少了数千个。另外,旧版森林草莓基因组均采用geneXXXXX命名基因,而V4基因组采用新的基因命名方式FvH4_XgXXXXX。为了改善新版基因组注释质量,建立了新注释v4.0.a2。在新注释中,基因数量由28,588个增加到34,007个,BUSCO评估完整度高达98.1%;调整了 8,342个现有基因的基因模型,添加了 9,029个新基因,10,176个基因能够产生可变剪切本。利用前期发表的大量转录组数据,建立所有基因在46种不同组织中的表达谱,方便读者查询。此外,鉴定了 84个已知miRNA基因和63个草莓特有miRNA基因,并预测了它们的靶基因。综上所述,我们的研究表明SMRT测序在识别可变剪切方面有非常大的优势,同时为后期对不同剪切本的功能研究提供了丰富的资源。此外,可变剪切不同类型的转变可能有助于果实形成时基因表达的快速变化。新注释在基因预测的准确性和完整性方面得到了显著改善,有利于草莓中的基因功能研究以及蔷薇科其他园艺植物的比较基因组分析。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S668.4
【部分图文】：

ｇ－?Ａ?ＡＡＡ?Ａ?Ａ?關■關??Ｖ?ＷＦｔａｔ?ｉｓ?ｂａｓｅ?１？?Ｗｈａｔ?ｉｓ?ｂａｓｅ?２？?Ｗｈａｔ?ｉｓ?ｂａｓｅ?３？??图１－１?Ｓａｎｇｅｒ测序与第二代测序的原理比较（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ?ａｎｄ?Ｊｉ?２００８）??Ｆｉｇ．１－１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?Ｓａｎｇｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｗｉｔｈ?ｎｅｘｔ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?（Ｓｈｃｎｄｕｒｅ??ａｎｄ?Ｊｉ?２００８）??Ｓｏｌｕｌ测序技术由ＡＢＩ公司于２００７年推出的测序技术，它运用连接酶催化的反??应对ＤＮＡ进行测序，替换了之前的聚合酶链式反应。Ｓｏｈｄ测序以荧光标记的寡核??苷酸的不间断合成为基础，对ＤＮＡ片段进行扩增和测序。这个测序平台的单碱基??质量最高且成本低，被广泛应用于ＳＮＰ的鉴定，但由于Ｓｏｌｕｉ产生的读段在二代测??序中最短，因此不适用于转录组和基因组的组装。??目前使用最多的是ｌｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ测序技术，因其性价比最高，所以应用最??广泛。Ｉｌｌｕｍｍａ平台使用边合成边测序技术（ＳＢＳ）和３’端可逆的终止子技术应用??于测序中，能够实现平行化和自动化测序。测序过程中，往每个泳道加入四种不同??的荧光标记的核苷酸（Ａ、Ｔ、Ｃ和Ｇ）和ＤＮＡ聚合酶。在聚合酶的作用下

或影响ｍＲＮＡ的稳定性或翻译能力（Ｒｅｄｄｙ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１３）。对于多外显子的??ｍＲＮＡ，剪切模式包含多种方式，包括外显子跳跃（ＥＳ）、内含子保留（ＩＲ）、可变??受点（ＡＡ）和可变供点（ＡＤ）（图１－３）?（Ｂｌａｃｋ?２００３）。大部分物种一半以上的基因都含??有多条剪切本，因此，基因的可变剪切极大地增加了整个转录组和蛋白质组的复杂??性和灵活性。??，ｓｏｆｏｎｎ?１?ｉ＞〇ｒ〇ｎｎ?Ｉ?■■■■■■■?ｗｍｍｍａｍ??ＰｒｃｍＲＮＡ?ＭＢ?ＭＢ?ＭＢ?Ｗ?■■■■■?Ｈｉ?ＢＨｉ??ｌｓｏｆｏｒｍ２?ｌ％ｏｆｏｍ２??Ｅｘｏｎ?ｓｋｉｐｐｉｎｇ?（ＥＳ）?Ｉｎｔｒｏｎ?ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ?（ＩＲ）??Ｉｗｆｏｒｍ?Ｉ??Ｐｒｃ－ｍＲＮＡ?ｐｒｔ－ｍＲＮＡ??Ｉｓｏｆｏｍｔ?２?ｌｓｏｆｏｒｍ?２??Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ?ａｃｃｅｐｔｏｒ?ｓｉｔｅｓ?（ＡＡ）?Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ?ｄｏｎｏｒ?ｓｉｔｅｓ?（ＡＤ）??图１－３可变剪切的主要类型（Ｂｌａｃｋ?２００３）??Ｆｉｇ．?１－３?Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ?ｓｐｌｉｃｉｎｇ?（Ｂｌａｃｋ?２００３）??８??

１４８个全长转录本和３６８，５７０个非全长转录本（表２－４）。转录本的长度密度图显??示三个明显的峰与三个文库的预期大小相一致，转录本的平均长度为２，４６６?ｂｐ，长??度显著大于草莓注释基因的平均长度（Ｕ８７?ｂｐ）（图２－２ａ）。通过ＧＭＡＰ?（Ｗｕ?ａｎｄ??Ｗａｔａｎａｂｅ?２００５）将转录本比对到Ｆ．?基因组ｖ２．０．ａｌ，发现８９．２％的转录本能够??比对到１３，２８４个已注释基因（总基因数量为３３，６７３）。１３，２８４个基因中有２，２２９个基??因上只有一条转录本（图２－２ｂ），剩余８３．２２％基因含有两条以上的转录本。每个基??因的对应的转录本数量的中位数约为１０；其中转录本最多的基因有３，５６１条转录本。??为了验证三代测序能否用于计算基因的表达量，我们用二代Ｉｌｌｕｍｉｎａ??Ｈｉｓｅｑ２５００平台对ＳＭＲＴ测序相同样品进行链特异性测序，产生１６Ｇ高覆盖度的读??段。通过散点图（ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）来评估ＳＭＲＴ测序与Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序之间表达水平的??相关性，最终得到它们之间的相关性（ＲＡ２）只有０．１７?（图２－２ｃ），说明ＳＭＲＴ测序??不适合计算基因的表达水平。不过
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本文编号：2853427