基于体细胞胚胎发生的甜瓜转基因体系构建

发布时间：2020-10-27 00:14

　　 转基因技术是植物基因功能研究的最有效技术之一,也是未来作物精准育种的候选途径。但是由于再生体系不成熟等因素,转基因技术在大多数蔬菜作物中应用还存在障碍。甜瓜是我国乃至全世界的重要蔬菜作物。传统的甜瓜转基因体系存在着再生效率低、嵌合体概率高等缺陷。本研究从建立高效甜瓜体细胞胚途径再生体系入手,研究了以不同基因型甜瓜种子切块为外植体,诱导愈伤组织从而萌发胚胎,最后再生为完整植株的再生体系。并在此基础上,建立了基于农杆菌介导的甜瓜转基因技术体系。取得主要成果如下:1、建立了基于体细胞胚胎发生的甜瓜再生体系:通过筛选激素种类和激素浓度配比,以及对十二种甜瓜基因型进行体胚的诱导,发现粗皮甜瓜材料'Vedrantais'在激素组合2,4-D和6-BA中诱导体胚效率最高,其余几种基因型甜瓜能够诱导愈伤组织形成,且愈伤组织不断膨大,但是体细胞胚产生概率极低。此外,诱导体细胞胚形成最佳培养基配方(1L)为:MS + 30g蔗糖+ 2 mg/L 2,4-D+ 0.1mg/L6-BA,液体培养7-8周,再生固体培养基:MS + 30g蔗糖;生根培养基配方:MS+15g蔗糖。2、利用二元质粒法构建了基于pBBRacdS的超级农杆菌:为提高根癌农杆菌介导的甜瓜转化效率,导入pBBRacdS质粒载体,实现在农杆菌工程菌中表现ACC脱氨酶活性,可降低农杆菌侵染后外植体或愈伤组织细胞中乙烯含量,提高再生效率。此后,通过二元质粒法将目标基因CmWRKY27过表达载体经历两次电转导入含有pBBRacdS的根癌农杆菌,对甜瓜进行侵染。3、获得了甜瓜转基因植株:将种子切块预培养两天,用含双载体的农杆菌菌液进行侵染后共培养,液体选择培养基:EI液体培养基+5mg/LHygromycin+ 25 mg/L Timentin;固体选择培养基:MS + 30g 蔗糖 +15 mg/L Hygromycin +100mg/LTimentin。结果显示,转化体系的转化率为0.18%。该体系筛选效率高,有效节省后续鉴定工作量。本实验建立了基于体细胞胚途径的甜瓜再生及转基因体系,提高再生效率并降低嵌合体概率。有助于甜瓜的功能基因研究,为将来的甜瓜分子设计育种提供重要技术储备,并为其他葫芦科作物提供借鉴。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S652
【部分图文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｍｅｌｏｎ?４ＸＬＨ，?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｂｙ?２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ?０．１?ｍｇＡ－／??激素的液体培养基中培养５闾，移至固体培养基（不含激素）中１周，不断分ｂ在液体培养基中培养７周后；ｃ在液体培养基中培养１０周后．??ｅｅｋｓ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?ｈｏｒｍｏｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?ｍｅｄｉｕｍ，?ｔｒａｎｓｆｅｒ?ｔｏ?ｓｏｌｉｄ?ｍｅｄｉｕｍ?（ｗｎｅｓ）?ｆｏｒ?１?ｗｅｅｋ，?ａｎｄ?ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ?ｃａｌｌｕｓ；?ｂ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｆｔｅｒ?７?ｗｅ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ａｆｔｅｒ?１０?ｗｅｅｋｓ??期间也尝试过将在液体中培养５周的‘?Ｘ?Ｌ?Ｈ＇外植体转移到不含激素的固中，结果如图２．２ａ，仍是在不断形成白色蓬松的愈伤组织。继续培养图２．２?ｃ形成的仍都黄色或黃白色海绵状趦于褐化的非胚性愈伤组织。??改用激素组合ＮＡＡ?＋?６－ＢＡ结果如下表２．３，也是诱导出疏松的非胚性。而６－ＢＡ?＋?１ＡＡ的激素组合则使外植体叶片状的不断膨大，分化出少，会形成不定根。后续培养放在同一培养基上外植体继续膨大，并伤组织出现。??培养基中不同配比浓度６－ＢＡ＋ＮＡＡ对培养＿３用甜瓜＞ＸＬＨ’愈伤组织诱导的影

?ＪＳ?ＨＤＺ??翁藝＿??图２．２不同基因型甜瓜液体培养５周后愦况（激素组合２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?５?ｗｅｅｋｓ?ｌｉｑｕｉｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ?ｍｅｌｏｎ?（Ｈｏｒｍｏｎｅ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：?２，４－Ｄ??２ｍｇ／Ｌ－ｌ－６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｓ３?围?Ｂｉ??图２．３甜瓜品种‘ＡＭ’液体培养５周（ａ）后和７周后（ｂ－ｃ）情况（激素组合２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ??０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｍｅｌｏｎ?ｆｃＡＭ９?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?ｌｉｑｕｉｄ?ｍｅｄｉｕｍ?ａｆｔｅｒ?５?ｗｅｅｋｓ（ａ）?ａｎｄ?７?ｗｅｅｋｓ（ｂ－ｃ）??（Ｈｏｒｍｏｎｅ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：?２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??２０??

２ｍｇ／Ｌ－ｌ－６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｓ３?围?Ｂｉ??图２．３甜瓜品种‘ＡＭ’液体培养５周（ａ）后和７周后（ｂ－ｃ）情况（激素组合２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ??０．１?ｍｇ／Ｌ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｍｅｌｏｎ?ｆｃＡＭ９?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?ｌｉｑｕｉｄ?ｍｅｄｉｕｍ?ａｆｔｅｒ?５?ｗｅｅｋｓ（ａ）?ａｎｄ?７?ｗｅｅｋｓ（ｂ－ｃ）??（Ｈｏｒｍｏｎｅ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：?２，４－Ｄ?２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ?０．１?ｍｇ／Ｌ）??２０??
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本文编号：2857726