柑橘无融合生殖和嫁接嵌合的分子基础研究

发布时间：2020-10-29 06:38

　　 大多数柑橘通过无性繁殖产生后代,主要体现在两个途径:一是种子通过无融合生殖途径;二是农艺措施上通过嫁接的繁殖方法。无融合生殖产生的柑橘多胚现象使大多数柑橘杂交后很难得到杂种,影响了育种效率;但同时无融合生殖导致性状不分离,为固定杂种优势提供了重要的途径。嫁接作为传统的无性繁殖方法,通过接穗—砧木复合体的形式改良作物的抗性、品质和产量等,已经广泛应用于柑橘等多年生果树的良种繁育。嫁接嵌合体是嫁接过程中产生的一类特殊材料,为研究植物组织细胞层发育及细胞层间相互作用提供了宝贵材料。本研究针对柑橘无性繁殖的特性,通过分子标记开发验证及转录组数据比较,揭示了多胚性状的遗传规律及珠心胚产生的分子基础;分析了柑橘砧木—枳(甜橙为对照)作砧木对接穗生长发育、代谢物积累及DNA甲基化水平的影响,并解析了枳和甜橙的地上与地下组织DNA甲基化图谱;利用两组柑橘嫁接嵌合体构建了柑橘不同组织器官的细胞层起源模型,并初步筛选了响应细胞层间互作的基因及细胞层特异表达的基因。主要研究结果如下:1、多胚候选基因分析及关联分子标记开发验证通过对前期定位的80Kb多胚候选区段进行克隆分析,确定该区段共有11个候选基因。利用11个候选基因序列SNP与多胚性状进行局部关联分析,锁定了两个与多胚性状高度关联的候选基因(Cg4g018970和Cg4g018910)。在基因Cg4g018910中,发现有10个SNP和一个6bp的缺失与多胚性状高度关联。进一步将6bp的缺失开发成共显性InDel标记,利用该标记在786份柑橘资源中验证分析发现,所有213份多胚材料中均存在6bp的缺失,而所有573份单胚材料均不存在6bp的缺失。同时,利用该标记对“HB柚(单胚)×Fairchild橘(多胚)”杂交F_1代群体进行分析,发现124株已有表型的后代中58个多胚单株均存在6bp的缺失,66个单胚单株均不含有6bp的缺失。以上结果表明,6bp的缺失与柑橘多胚性状高度连锁,该InDel标记可以有效鉴别柑橘单胚和多胚基因型。2、单胚和多胚柑橘品种转录组比较对单胚的晚白柚和多胚的甜橙叶片、胚珠、果实和种子四个不同组织的转录组数据进行比较,分别从晚白柚和甜橙中筛选到1637和1840个在胚珠中特异高表达的基因,其中有853个基因在晚白柚和甜橙胚珠中同时特异高表达。GO富集分析发现,只在甜橙胚珠中特异高表达的987个基因与853个在单胚和多胚品种中同时高表达的基因富集的生物过程相似,暗示珠心胚与合子胚经历着相似的发育起始过程。为了探究珠心胚与合子胚起始发育的分子基础,选取了3对单胚与多胚柑橘品种(柚—葡萄柚、枸橼—柠檬、克里曼丁橘—椪柑)对珠心胚起始发育关键时期的胚珠进行了比较转录组分析。结果筛选到29个同时在三对材料中呈现显著差异表达的基因,基因功能注释分析发现其中部分基因与逆境响应及氧化还原反应等生物过程相关。此外,调控柑橘多胚性状的关键基因CitRWP在多胚品种胚珠中的表达量显著高于单胚品种。3、枳砧嫁接对接穗的影响通过设置枳砧和本砧嫁接甜橙两个组合进行嫁接对比实验,分析枳砧嫁接对接穗生理指标、代谢及甲基化水平的影响。接穗生长指标及矿物质元素测定结果表明,枳作砧木对接穗有矮化作用,枳砧嫁接能够提高甜橙中钾(K)和硼(B)元素的含量,同时降低了钙(Ca)、镁(Mg)、锶(Sr)和铅(Rb)等元素的含量。对接穗叶片进行广泛靶向代谢组分析,共检测到682种代谢物,其中有47种代谢物在枳砧嫁接的接穗叶片中含量显著升高,21种代谢物含量显著降低。进一步分析发现差异代谢物主要富集在类黄酮代谢通路,类黄酮代谢通路上游的基因也上调表达,表明枳砧嫁接能够促进接穗类黄酮积累。此外,对接穗中DNA甲基化相关基因表达分析,发现与去甲基化相关的3个DME(DNA Glycosylases DEMETER)基因上调表达,重亚硫酸盐测序结果表明枳作砧木导致接穗中DNA甲基化水平降低3%左右。4、枳和甜橙的地上与地下组织甲基化图谱为了比较常用砧木与栽培品种的DNA甲基化模式差异,对枳和甜橙地上组织(shoot)和地下组织(root)进行重亚硫酸盐测序分析。结果表明,枳的地上组织、枳的地下组织、甜橙的地上组织和甜橙的地下组织四个组织中,CG型甲基化水平处于42.75%至49.14%之间;CHG型甲基化水平处于23.78%至28.89%之间;CHH型甲基化水平为7%左右。枳和甜橙相比,枳中CG和CHG型的DNA甲基化水平比甜橙低。地上和地下组织相比,枳地下组织CG和CHG型甲基化水平高于地上组织,而甜橙中则相反;CHH型甲基化水平地下组织均低于地上组织。DNA甲基化位点在染色体上呈不均匀分布状态。DNA甲基化与转录组数据联合分析,发现DNA甲基化能部分影响基因表达水平。5、嫁接嵌合体遗传机制及柑橘不同组织器官细胞层起源基于基因组信息,开发了一系列InDel和SNP标记从分子层面验证了‘早红’和‘红肉桃叶橙’两组嵌合体的细胞层起源。利用两组嵌合体材料,追踪柑橘不同组织器官的细胞层起源,发现柑橘的叶片和花器官各组织均由三层细胞共同发育而来;果实外果皮、囊衣和汁胞由三层细胞共同发育而来,而中果皮和大维管束起源于L2/L3层细胞;在种子中,内种皮源自三层细胞共同发育,而外种皮、子叶、胚以及胚萌发的幼苗由L2/L3层细胞发育而来。同时发现,在不同组织器官中,各细胞层的贡献比例不同。利用‘早红’嵌合体及两亲本转录组数据,在‘早红’嵌合体外果皮或汁胞中筛选到215个由于细胞层间互作激活表达的基因,155个被细胞层间互作抑制表达的基因;利用转录组数据结合两亲本之间基因编码区SNP信息鉴定了59个L1层特异表达的基因和1116个L2/L3层特异表达的基因。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S666
【部分图文】：

图 1-1 单胚（左）与多胚（右）柑橘的种子（A）和幼苗（B）形态。Fig. 1-1 Phenotype of seeds (A) and seedlings (B) from monoembryonic (left) and polyembryonic(right) citrus.1.2.1.2 嫁接繁殖嫁接，是通过人工营养繁殖的一种方式，即把一个植株的枝或芽切下，紧密贴合到另一个植株的茎或根上，使结合在一起的两个部分长成一个完整的植株（Melnykand Meyerowitz 2015）。嫁接过程中被接上去的枝或芽称为接穗，承受接穗的部分称为砧木。嫁接主要是利用植物较强的再生能力，切割产生的伤口能够产生愈伤组织使两部分组织有机的结合（Melnyk 2016）。嫁接有着非常久远的历史，在公元前1560 年的中国、公元前 500 年的地中海地区以及罗马地区，都有关于使用嫁接技术的证据记载（Lee and Oda 2003；Mudge et al 2009）。在果树、蔬菜和花卉等其他经济作物生产中，嫁接繁殖应用非常广泛，并产生了巨大的经济价值。通过嫁接，可

柑橘无融合生殖和嫁接嵌合的分子基础研究嫁接繁殖在柑橘中应用非常广泛，几乎所有的栽培品种都是嫁接在砧木上进行生产。柑橘嫁接繁殖一般包括：砧木和接穗的选择、削芽、砧穗对接、绑缚、剪砧和解绑等过程（图 1-2）。嫁接繁殖可以快速实现优良柑橘品系的规模化生产，同时由于砧木和接穗分别来自两个不同个体，两者之间存在着显著的相互作用，砧木对接穗品种的长势、童期、产量、品质和栽培适应性等具有重要影响。

图 1-3 三类嵌合体茎尖横切示意图（Marcotrigiano 1997）。（A）扇形嵌合体；（B）周缘嵌合体；（C）混合嵌合体。白色和灰色分别代表两种不同遗传来源的细胞。Fig. 1-3 Schematic diagram of shoot apical meristem crosscutting in three types of chimeras(Marcotrigiano 1997). (A) Sectorial chimera; (B) Periclinal chimera; (C) Mericlinal chimera. Whiteand grey colors represent two kinds of cells with different genetic origin.1.2.4.2 植物嵌合体的形成方式植物嵌合体的形成主要通过两种途径：一种是植物顶端分生组织特定部位细胞发生突变形成嵌合体；另外一种是两个植物个体的细胞镶嵌发育成嵌合体。在植物顶端分生组织发育过程中，由于受到外界或者内部刺激，分生组织特定部位的细胞发生变异，而其周围的细胞仍然保持正常状态，发生变异的细胞和没有发生变异的细胞同时分裂、分化，共同发育成一个植物个体或器官（图 1-4）。植物顶端分生组织发生突变形成嵌合体的现象非常普遍，如葡萄果皮色泽嵌合体
【参考文献】

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1 吴巨勋;肖慧玲;王小花;伊华林;;嫁接嵌合体‘早红’脐橙果实细胞来源鉴定及其糖酸和香气物质分析[J];园艺学报;2014年10期

2 张斯淇;徐强;邓秀新;;无融合生殖与柑橘多胚现象的研究进展[J];植物科学学报;2014年01期

3 王海宁;葛顺峰;姜远茂;魏绍冲;陈倩;孙聪伟;;不同砧木嫁接的富士苹果幼树~(13)C和~(15)N分配利用特性比较[J];园艺学报;2013年04期

4 王燕;李俊星;陈利萍;;利用芸薹属植物嵌合体对组织与器官细胞层起源的研究[J];中国细胞生物学学报;2011年08期

5 吴洪明,林宝明,赖钟雄,吕柳新,林桂芳,潘东明,杨江帆;一个芸香科属间嫁接嵌合体的拉丁名称:+Citroponcirus‘Hormish’[J];热带亚热带植物学报;2004年02期

6 洪棋斌,向素琼,陈克玲,陈力耕;两对互补的显性基因控制着柑桔属和枳属的无融合生殖[J];遗传学报;2001年11期

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2 张斯淇;柑橘无融合生殖的遗传分析和相关基因挖掘[D];华中农业大学;2017年

3 刘政;柑橘珠心胚起始转录组分析及体细胞胚发生相关基因CsFUS3功能鉴定[D];华中农业大学;2015年

4 张敏;柑橘果实扇形嵌合体的分离及两组嫁接嵌合体的遗传研究[D];华中农业大学;2006年

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本文编号：2860531