苹果免疫基因MdFLS2的克隆与拟南芥转化功能鉴定

发布时间：2020-11-07 07:23

　　 新疆野苹果生长中国中亚天山山脉,是现在栽培苹果的祖先种,其遗传价值不断地被人们所重视。但近些年,新疆野苹果遗传多样性也同样面临着被破坏的危机,正因如此,对新疆野苹果种质资源和生物资源的开发利用迫在眉睫。FLS2是植物免疫系统中的重要组分,与植物识别外来病原菌入侵,激活下游的抗病基因的表达,引发植物的MAPK级联放大反应和活性氧的爆发等一系列植物的抗病反应有关,在植物对病菌的应激反应中起着重要作用。虽然在拟南芥中FLS2功能机制的研究已经较为透彻,但是苹果由于自身基因的复杂性,许多针对FLS2在苹果上的研究尚在起始阶段,国内少见关于苹果上FLS2的研究。因此,在本次研究中,我们在新疆野苹果中克隆出了苹果中的FLS2基因,构建出相应的表达载体,并且得到了其转基因拟南芥植株,使用简单的统计学方法就MdFLS2在拟南芥中的异源表达状况,和一些在转基因拟南芥中出现的表型进行了一些研究。与此同时还构建了FLS2和BAK1激酶区域的原核表达载体,纯化得到了相应的蛋白,并取得了一些结论。为苹果中FLS2的功能和以后更深层次的工作奠定了基础。本研究的主要结果如下:1.确定了新疆野苹果中FLS2的片段大小和相应的序列,并通过生物信息学分析了其蛋白质的结构区域,确定了FLS2各部分的功能。2.MdFLS2于拟南芥中超表达,降低了拟南芥种子发芽率,拟南芥纯合子转化植株生长变缓。3.超表达MdFLS2部分恢复了拟南芥突变体FLS2对细菌鞭毛蛋白的敏感性。4.构建了相应的MdFLS2和MdBAK1激酶区域的原核表达载体,并且成功的诱导和纯化出了MdFLS2和MdBAK1激酶区域的蛋白,为以后的蛋白方面的实验打下了基础。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S661.1;Q943.2
【部分图文】：

图 1.植物和动物受体蛋白激酶的共同反应模式Fig.1. Common themes in plant and animal receptor protein kinases.(Shin-Han Shiu et al, 2001)体样蛋白激酶的功能在生长过程中总会接触许多的外界信号，作为受体激酶，RLKs 参与植发育，激素信号转导和植物中的生物和非生物胁迫的应对机制(Li et al为透彻的 LRR-RLK 为例，在拟南芥中，EMS1(excess microsporocy 和小肽 TPD1(tapetum determinant1)在花药细胞的分化中起着重要作用。变体的拟南芥花药缺乏绒毡层细胞，但产生额外的微孢子体细胞，虽它的工作原理，但是影响拟南芥的花药分化是毋庸质疑的。(Zhao et al., 2003, Canales C et al., 2002, Wang et al., 2012)。BRI1(brasinosteroid ins菜素诱导途径中重要的受体蛋白。参与了 BR 信号的感知和早期的信号植物细胞壁的生物合成(Xu et al,2008)，GSO 和 RPK1 参与植物胚to R et al., 2008)，OsGIRL1 与水稻的盐胁迫，热胁迫等紧密相关(Park

图 2 FLS2 信号转导途径Fig.2 FLS2 signalling pathway (Silke Robatzek et al., 2012)1.3.3 FLS2 表达的空间和空间上的差异性植物不同于动物，由于植物缺乏像动物一样专化的免疫细胞，每一个单独的植物细胞都应该具有识别和发现病原体并且将这个信号传导出去的能力，这就需要FLS2在植物组织中的组成型表达，最近，在植物的各个组分，包括幼苗，叶子，和根中都发现了flg22引发的防御反应现象(Zipfel et al., 2004; Millet et al., 2010; Jacobs et al., 2011)，这些都表明flg22受体在几乎所有组织中表达，这与mRNA表达鉴定的结果和FLS2-绿色荧光蛋白(GFP)(Gomez-Gomez,Boller, 2000; Robatzek et al., 2006)的发现一致。在拟南芥中，FLS2的表达水平在植物组织中有明显的空间性(Faulkner and Robatzek, 2012)，一个非常显著的例子，在拟南芥的根系中FLS2的表达量会显著低于它在叶片中的表达量，具体来说，植物的根能被flg22激活，并且引发典型的防御反应(Millet et al., 2010; Jacobset al., 2011);但是在主根中基本检测不到FLS2的活性，只限于生长的侧根等。而在叶片中的气孔和创

3.1 MdFLS2 的基因的生物信息学分析3.1.1 MdFLS2 的蛋白质性质和进化树分析在GDR上使用MdFLS2的蛋白序列BLAST得到其GDR登录号为MDP0000254122，序列测定和分析表明，MdFLS2 存在于苹果的第 5 条染色体上，CDS 序列包含两个外显子和一段内含子，其开放阅读框为 3473 bp,预测其完整的蛋白大小为 12.7 kD，共编码1157 个氨基酸，预计等电点为 6.22。使用 MdFLS2 和 AtFLS2 的蛋白质序列在 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行 Blast，与之将相似度高的 17 个不同物种植物的 FLS2 蛋白序列使用 MEGA5 软件构建相应的进化树(图 3)，图中的比例尺 0.05 代表每 20 个氨基酸中有 1 个不同，从图中可以看出 AtFLS2 和 MdFLS2 分别位于进化树两个不同的树枝上，氨基酸序列上有一定的差别，因此研究 MdFLS2 在转基因拟南芥中的功能和 AtFLS2 的功能是否具有相似性，它们的相关程度如何，这对研究 MdFLS2 的功能具有积极意义。
【参考文献】

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本文编号：2873626