龙眼体胚发生早期IncRNAs的鉴定及表达调控研究

发布时间：2020-11-09 12:24

　　 龙眼(Dimocarpus longan Lour.)属无患子科(Sapindaceae)龙眼属,是著名的热带亚热带特色果树。龙眼体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis,SE)系统是研究龙眼胚胎发育的良好系统。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)参与可变切割、转录干扰、DNA甲基化调节和蛋白质修饰,但对于lncRNAs在植物体胚发生过程中的研究还未见报道。在本研究中,以胚性愈伤组织(embryonic callus,EC)、不完全胚性紧实结构(Incomplete embryonic compact structure,ICpEC)、球形胚(globular embryo,GE)为试验材料,采用Ⅲumina HiSeq测序技术系统地鉴定了龙眼体胚发生早期3个阶段的lncRNAs;对lncRNAs的差异显著性分析结果,进行筛选及表达分析;通过KEGG富集分析,构建生长素、脱落酸与乙烯响应因子相关的lncRNAs调控网络,进行龙眼SE早期以及在相应激素处理下的表达分析,并对lncRNAs靶基因ERF相关的家族成员进行鉴定;预测lncRNAs与miRNA的作用关系网络,通过miRNA的过表达与抑制表达处理,使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术对其相关的lncRNAs与mRNAs进行表达量验证;构建lncRNAs的过表达载体,通过PEG转化与农杆菌介导法转入龙眼原生质体与胚性愈伤组织。研究内容主要如下:1龙眼体胚发生早期相关的lncRNAs的鉴定与靶基因预测采用Ⅲumina HiSeq测序技术对龙眼的3个样本(EC、ICpEC与GE)进行高通量测序,鉴定新型lncRNAs为7643个,其中6005个检测到表达。通过样本间两两对比的差异表达lncRNAs发现,在龙眼早期SE过程中,GE阶段存在更多特异的lncRNAs,作用主要在ICpEC到GE阶段。lncRNAs的功能主要通过cis或trans方式作用于靶基因来实现,对lncRNAs差异显著的靶基因进行KEGG富集分析发现,在EC vs.GE与ICpEC vs.GE中“植物-病原菌互作”与“植物激素信号转导”途径最富集。2龙眼体胚发生早期lncRNAs及其靶基因的筛选与表达分析为了确定龙眼早期SE显著差异lncRNAs的表达,挑选了20个在RNA-Seq中表达量差异显著lncRNAs以及5个与植物激素信号转导相关的lncRNAs进行qRT-PCR验证。除了LTCONS-00027337之外,其余24个lncRNAs均可以在EC、ICpEC与GE中检测到表达。结果显示,24个lncRNAs中有16个lncRNAs的RNA-Seq与qRT-PCR的表达趋势一致。为进一步了解“植物激素信号转导”途径在龙眼体胚发生早期的作用,鉴定了其中6个关键的lncRNAs。在qRT-PCR中,6个lncRNA对其靶基因均为正调控关系,并且为顺式调节的。推测与植物激素信号转导相关的lncRNA主要在早期龙眼SE中起顺式调控的作用。对lncRNAs靶基因ERF家族进行系统地鉴定,并对5个在龙眼早期SE过程中富集的ERF基因进一步分析发现。结果进一步表明,随着龙眼早期SE进行内源激素等方面发生显著变化,为了促进胚胎的正常发育,需要更多的DlERF基因参与。通过对5个在龙眼早期SE差异显著表达的DlERF基因进行qRT-PCR与RNA-Seq表达结果对比发现,大部分在龙眼早期SE 3个阶段的表达趋势一致,且其中3个DlERF基因在龙眼GE阶段表达量最高。由此可见,从EC到GE阶段需要更多的ERF基因来参与GE阶段的维持,也进一步说明在早期SE过程中,细胞分裂分化和抗性等方面也逐渐增强。使用不同浓度的外源激素处理龙眼胚性愈伤组织,从复杂的关系网络中可以看出,作为植物激素相关的lncRNAs,在龙眼SE过程中发挥着至关重要的作用。3龙眼体胚发生早期lncRNAs与miRNAs调控关系除了与编码蛋白相互作用外,lncRNAs也可能与miRNA相互作用。本试验预测了龙眼lncRNAs作为miRNA的前体、靶基因以及内源诱捕靶标(endogenous target mimic,eTM)。为了进一步验证在龙眼SE早期发育期间lncRNA、miRNA和mRNA之间的关系,对Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a的预测网络进行qRT-PCR验证。通过对Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a过表达和抑制表达的样品中表达量分析,我们发现了龙眼中早期SE期间Dlo-miR172a与其相关的lncRNA和mRNA具有与预测相同的表达趋势。然而,DlomiR398a、Dlo-miR159a.1与其相关的mRNA和lncRNA之间的调节关系复杂,需要进一步探索。4龙眼体胚发生早期lncRNAs的过表达载体构建及瞬时表达本试验构建了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334的过表达载体,利用农杆菌介导法与PEG转化法,实现了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334在龙眼原生质体与愈伤组织中过表达。从qRT-PCR结果中看出,在原生质体中,LTCONS-00042843与LTCONS-00006334及其靶基因均表现为显著上升,也进一步验证了LTCONS-00042843与LTCONS-00006334对其靶基因为正调控关系。LTCONS-00042843作为miR172a的eTM,对其存在负调控作用。但对于转入龙眼愈伤时,LTCONS-00042843与LTCONS-00006334的靶基因均表现出相反的趋势,与在体胚中的调控以及转入龙眼原生质体中的趋势存在差异,推测是由于试验的材料不同导致其调控网络或调控偏好性存在差异。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S667.2
【部分图文】：

图 2-1 龙眼体胚发生早期 lncRNAs 的长度分布Fig.2-1 Length distribution of lncRNAs during early longan SE图 2-2 龙眼体胚发生早期 lncRNAs 的外显子数目分布Fig.2-2 Exon number distribution of lncRNAs during early longan SE

22图 2-2 龙眼体胚发生早期 lncRNAs 的外显子数目分布Fig.2-2 Exon number distribution of lncRNAs during early longan SE对 7643 个 lncRNAs 以及 47169 个 mRNAs 进行表达量分析表达的新型 lncRNAs 为 6005 个，新型 mRNAs 为 15233 个 23886 个。在 6005 个新型 lncRNAs 在 3 个样本中的分布为ICpEC 阶段 5320 个以及 GE 阶段 5568 个。其中 3 个样本共有的790 个；EC 与 ICpEC 共有的有 139 个；ICpEC 与 GE 共有的有 共有的有 165 个。对 687 个特异表达 lncRNAs 分析中发现 lncRNAs 为 159 个、ICpEC 中为 153 个、GE 中为 375 个。

图 2-3 EC、ICpEC 和 GE 样本间特异表达 lncRNAs 的 Venn 图iagram showing the specifically expressed lncRNAs between ECsamples发生早期 lncRNAs 分类与家族注释05 个 lncRNAs 相对于最接近编码蛋白基因位置，将 34编码蛋白没有任何重叠的基因间 lncRNAs(intergenic基因座上的基因内 lncRNAs(intragenic lncRNAs)以及的反义 lncRNAs (antisense lncRNAs)[171; 172]。结果表93.37%的 lncRNAs 为基因间 lncRNAs，0.38% 的 lncR 6.25%的 lncRNAs 为反义 lncRNAs（图 2-4）。As 家族注释中，对比 RNA 的二级结构保守区域，m
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本文编号：2876427