枣果实色泽性状形成的分子机制研究

发布时间：2020-11-10 03:53

　　 枣(Ziziphus jujuba Mill.)为鼠李科枣属植物,是原产我国的特有经济林树种,其枣果皮红色素属于天然色素,具有丰富的酚类物质及较高的营养价值,目前对枣果皮色素成分及其分子调控机制的研究尚不清楚。本研究以‘骏枣’和颜色突变体‘胎里红’为试材,利用‘骏枣’基因组注释信息以及代谢组和转录组数据,对枣果皮花青苷的成分、生物合成及转录调控进行了系统的研究,为枣果皮天然色素及营养价值开发和利用提供了理论基础。主要研究结果如下:1.枣果实发育成熟过程中,‘骏枣’幼果时期的绿色是叶绿素决定的,而‘胎里红’的幼果时期的红色主要是花青苷引起的,与类胡萝卜素无关。枣果实成熟时期的红色则是由黄酮类物质、胡萝卜素和少量的花青苷叠加作用引起的。代谢组测试,共鉴定出171种黄酮类物质,其中花青苷类化合物有13种,116种黄酮类物质(黄酮醇、黄烷酮和异黄酮类)和42种苯丙烷素类化合物。代谢组、转录组联合分析,筛选获得参与花青苷合成2个结构基因(ZjANS和ZjUGT79B1)和8个转录因子(ZjMYB113、ZjMYB5、ZjGL3a、ZjGL3b、ZjTT8、ZjWDR1、ZjWDR2和ZjWDR3)。2.‘胎里红’枣果皮中主要花青苷组分为芍药素3,5-O葡萄糖苷和矢车菊素3-O芸香糖苷,其次是矢车菊素。在枣果实发育过程中,花青苷的含量与ZjANS和ZjUGT79B1的表达模式具有较高的相关性,它们瞬时过表达可明显提高果实的花青苷含量。酶促反应试验显示,ZjANS可以催化原花青素合成矢车菊素,而ZjUGT79B1可以识别UDP-鼠李糖苷,进而将矢车菊3-O葡萄糖苷糖基化后形成矢车菊素3-O芸香糖苷。芍药素3,5-O葡萄糖苷是枣果皮里含量最高的花青苷组分,研究筛选获得一个甲基化修饰的基因ZjCCoAOMT,其可以将矢车菊素3,5-O葡萄糖苷催化形成芍药素3,5-O葡萄糖苷。3.基于代谢组、转录组获得8个候选转录因子(ZjMYB113、ZjMYB5、ZjGL3a、ZjGL3b、ZjTT8、ZjWDR1、ZjWDR2和ZjWDR3),根据其不同组织和不同发育阶段的表达分析发现,ZjMYB5、ZjTT8和ZjWDR3与枣果皮花青苷含量的变化趋势相似。亚细胞定位结果显示ZjMYB5和ZjTT8定位在细胞核中,而ZjWDR3不仅定位在细胞核还定位在细胞质上。双荧光素酶结果发现,单独注射转录因子ZjMYB5可以激活ZjANS和ZjUGT79B1启动子的转录活性,ZjMYB5与ZjTT8协同表达可以明显提高其对ZjANS和ZjUGT79B1启动子的激活能力。添加ZjWDR3转录因子可以使增强效果更加明显,且GUS报告基因瞬时转化试验与双荧光素酶的结果一致。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S665.1
【部分图文】：

第一章 文献综述程在不同物种间高度保守。花青苷合成过程中依次是由查尔酮合成酶（CHS）、异构酶（CHI）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）、类黄酮 3’-5’-羧化酶（F3’5’H）、二氧 4-还原酶（DFR）、花色苷合成酶（ANS）和类黄酮糖基转移酶（UFGT）催化(Petroni et al. 2011；Markovic 2007；Holton et al. 1995)。这一反应过程分为前后，前部分由 CHS、CHI、F3H 和 F3’5’H 组成，这部分是黄酮类物质合成的公共途称为花青苷合成的前期合成反应；而 DFR、ANS 和 UFGT 等步骤则是花青苷合有催化酶，这部分反应称之为花青苷合成的后期合成反应。

图 1-4 果实中花青素生物合成发育与调控模型(Jaakola 2013)。Figure 1-4 Model of anthocyanin biosynthesis development and regulation in fruits花青苷的合成调控过程是一个十分复杂的过程，包含了大量的结构基因、非编码RNA、转录因子等等，其中以转录因子的研究最为深入。经试验证明参与花青苷调控的转录因子主要有 MYB、bHLH 和 WD40，这三种转录因子通常以复合物的形式特异的结合目的基因上游启动子中的顺式作用元件以调控花青苷合成相关基因的时空表达(Hichri et al. 2011)。MBW 复合体一般调控花青苷的合成、转运、修饰等结构基因，使得花青苷在细胞质内合成修饰，并最终转运至液泡中储存(Hichri et al. 2011)。研究表明，PAP1（MYB75）-GL3/TT8（bHLH）-TTG1（WD40）复合体能够促进拟南芥愈伤组织的花青苷合成(Zhou et al. 2012)。在葡萄果实发育过程中，MBW 复合体同样被证明在调控花青苷合成方面发挥重要作用(Hichri et al. 2010)。MYB、bHLH 和 WD40 转录因子形成的复合物在很多物种中被证明共同调控花青苷的合成，例如，在苹果、桃、草莓、葡萄、杨梅等物种中均发现 MBW 复合体在花青苷合成代谢途径中发挥积极的调控作用(Wu et al. 2014; Schaart et al. 2013; Zhang 2013; An et al. 2012)。另外，在杨梅果

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