梅Pm-miR319a及其靶基因Pm-TCP4在雌蕊发育中的调控作用
发布时间：2020-11-15 16:11
梅(Prunus mume Sieb.etZucc.)是蔷薇目蔷薇科李属多年生核果类植物。梅果实营养丰富,含有多种利于人体代谢的氨基酸,被誉为保健食品。雌蕊是果实形成的基础,而在生产中,经常出现雌蕊发育不良的现象。为揭示梅雌蕊发育的机理,本文在前人研究基础上,克隆了 Pm-miR319a前体和其靶基因序列;明确了 Pm-miR319a对靶基因Pm-TCP4的切割作用;进一步利用生物信息学方法对Pm-TCP4的结构与功能进行了分析;同时对梅Pm-miRS 19a及其靶基因Pm-TCP4在雌蕊不同发育阶段的表达进行了分析,主要结果如下:1前人的研究表明miR319a可能与梅雌蕊发育相关,我们克隆其前体序列,前体序列长229bp。对Pm-miR319a前体序列进行了分析,预测了二级结构。从数据库中得到了 19个其他物种的miR319a前体序列和成熟体序列,经过序列比对和系统发育分析,发现miR319a成熟体具有很高的保守性。这20个物种中,miR319a在进化关系上具有种间差异性。此外,预测了 Pm-miR319a的靶基因。结果显示,其靶基因包括Pm-TCP4,这与拟南芥相一致,表明miR319a靶基因具有保守性。2为了探究Pm-miR319a与梅雌蕊发育的关系,利用RT-PCR技术在梅栽培种'大嵌蒂'的花芽中克隆了这个基因的ORF。分析序列显示Pm-TCP4编码439个氨基酸,同NCBI上预测序列比对,比对结果吻合。经5'RACE验证,Pm-miRS 19a切割Pm-TCP4。对Pm-TCP4进行生物信息分析,结果显示Pm-TCP4编码的蛋白为亲水性蛋白,无信号肽且定位在细胞核,并具有跨膜结构,可以推测出它可能在细胞核的核膜上发挥作用。为探究Pm-miRS 19a与Pm-TCP4在雌蕊发育中的作用奠定基础。3为了探究Pm-miR319a及其靶基因Pm-TCP4在梅雌蕊发育中的作用,利用qRT-PCR技术,检测Pm-miR319a与Pm-TCP4在‘大嵌蒂’和‘龙眼’两个品种及‘大嵌蒂’不同雌蕊间(正常雌蕊与褐化雌蕊)的相对表达量。结果显示,Pm-miR319a在梅品种‘大嵌蒂’和‘龙眼’中表达趋势相近,且在‘大嵌蒂’中的表达量高于‘龙眼’中的表达量。观察Pm-TCP4在两个品种间的表达量,显示Pm-TCP4在‘大嵌蒂’中的表达量明显高于'龙眼'。而在'大嵌蒂'不同雌蕊表达分析显示,Pm-miR319a在正常雌蕊与褐化雌蕊表达量无明显差异,Pm-TCP4在褐化雌蕊中表达量高于正常雌蕊,说明Pm-CP4可能与雌蕊褐化的发生有关,进而影响梅花发生败育。对Pm-TCP4转录因子的下游基因预测,发现16个与花发育相关的基因,包含PmARF基因家族、PmCUC基因家族、PmCCoAMT基因、PmLOX2基因和PmARG7。Pm-TCP4可能通过它们影响雌蕊的发育。综上所述,Pm-miR319a通过调节其靶基因Pm-TCP4,间接调控雌蕊的发育。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S662.4
【部分图文】：
Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄ?ＤＮＡ?ｏｆ?‘Ｄａｑｉｉａｎｄｉ’??以‘大嵌蒂’花芽ＤＮＡ为模板，以ｊＰｗ－ｍｉＲＳＩＱａＦ和ＰｗｍｉＲ３１９ａＲ为上下游引物，进??行ＰＣＲ扩增得到了７７１ｂｐ的特异性条带（图２－２）。将获得的特异性片段进行切胶回收、??连接、转化、阳性克隆筛选和菌液ＰＣＲ检测，送５个阳性菌液公司测序，５个测序结果??相同。分析测序结果，表明‘大嵌蒂’中获得的Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ前体片段为２２９ｂｐ，包含??于７７１ｂｐ当中。但在序列中部分ｍｉＲＮＡｓ前体的碱基序列与基因组中序列略有不同，但??对其二级结构的形成不造成根本影响，其二级结构的自由能也变化不大。??Ｉ??图?２－２?Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ?前体?ＤＮＡ?片段??Ｆｉｇ?２－２?Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ??２．２梅Ｐｍ－ｍｉＲＪＩＱａ前体序列折叠??已知／Ｖｗ－ｍｉＲ３１９ａ的前体序列运用在线ＲＮＡ?Ｆｏｌｄｉｎｇ?Ｆｏｒｍ??（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｍａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ／ＲＮＡ－Ｆｏｌｄｉｎｇ－Ｆｏｒｍ?）对前体进行折叠
列经过两次剪切并运输加工，才形成了成熟的ｍｉＲＮＡ。对ｎｉｉＲ３１９ａ进行多序列比对分析，??结果显示他们前体序列的发卡结构处和成熟体区域显示出较高的保守性，其他区域的保守??性不高（图２－６）。对２０个物种ｍｉＲ３１９ａ前体序列的系统发育分析，可以帮助我们从ｍｉＲＮＡ??前体结构了解到不同物种间的进化关系。运用ＭＥＧＡ６软件构建进化树（图２－７），通过观??察系统进化树发现２０个物种ｍｉＲ３１９ａ前体序列的进化树分为两大分支，第－分支含有１０个??物种，第二分支也侖１０个物种。其中梅和桃亲缘关系最近，其次是玉米和苜蓿，香瓜和蓖??麻。苹果与香瓜、蓖麻和无油樟亲缘关系较近与拟南芥亲缘关系较远。这些都说明了??ｍｉＲ３１９ａ在进化关系上具有种间差异性。??２７??
、．：Ｉ??Ｂ?？?＾??＾?，—＇、、??图３－１?‘大嵌蒂’花芽总ＲＮＡ提取??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｆｒｏｍ?ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄｓ??２．２靶基因克隆及序列分析??根据预测的靶基因Ｐｍ－ｒｃ／＾序列分析，设计含有开放阅读框（ＯＲＦ）的特异引物，??以梅品种‘大嵌蒂’?ＣＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，将获得的特异片段进行切胶回收、??连接、转化、筛选阳性克隆和ＰＣＲ检测，５个阳性菌液公司测序，５个测序结果相同（图??３－２）。测序结果去掉非编码序列，显示靶基因片段大小为１３２０ｂｐ?（图３－３），编码４３９??个氨基酸，与梅基因组上预测的序列相似度９９．０９％。分析结果显示，Ｐｗ－７ｒ７＾序列包??含完整的开放式阅读框，以ＡＴＧ为起始密码子，以ＴＡＡ为终止密码子。??＼｜：＜１００??图３－２尸／７７－ＴＴ／Ｖ基因ｃＤＮＡ片段??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２?Ｐｍ－ＴＣＰ４?ｇｅｎｅ?ｃＤＮＡ?ｆｒ
本文编号：2884954
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S662.4
【部分图文】：
Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄ?ＤＮＡ?ｏｆ?‘Ｄａｑｉｉａｎｄｉ’??以‘大嵌蒂’花芽ＤＮＡ为模板，以ｊＰｗ－ｍｉＲＳＩＱａＦ和ＰｗｍｉＲ３１９ａＲ为上下游引物，进??行ＰＣＲ扩增得到了７７１ｂｐ的特异性条带（图２－２）。将获得的特异性片段进行切胶回收、??连接、转化、阳性克隆筛选和菌液ＰＣＲ检测，送５个阳性菌液公司测序，５个测序结果??相同。分析测序结果，表明‘大嵌蒂’中获得的Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ前体片段为２２９ｂｐ，包含??于７７１ｂｐ当中。但在序列中部分ｍｉＲＮＡｓ前体的碱基序列与基因组中序列略有不同，但??对其二级结构的形成不造成根本影响，其二级结构的自由能也变化不大。??Ｉ??图?２－２?Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ?前体?ＤＮＡ?片段??Ｆｉｇ?２－２?Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ??２．２梅Ｐｍ－ｍｉＲＪＩＱａ前体序列折叠??已知／Ｖｗ－ｍｉＲ３１９ａ的前体序列运用在线ＲＮＡ?Ｆｏｌｄｉｎｇ?Ｆｏｒｍ??（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｍａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ／ＲＮＡ－Ｆｏｌｄｉｎｇ－Ｆｏｒｍ?）对前体进行折叠
列经过两次剪切并运输加工，才形成了成熟的ｍｉＲＮＡ。对ｎｉｉＲ３１９ａ进行多序列比对分析，??结果显示他们前体序列的发卡结构处和成熟体区域显示出较高的保守性，其他区域的保守??性不高（图２－６）。对２０个物种ｍｉＲ３１９ａ前体序列的系统发育分析，可以帮助我们从ｍｉＲＮＡ??前体结构了解到不同物种间的进化关系。运用ＭＥＧＡ６软件构建进化树（图２－７），通过观??察系统进化树发现２０个物种ｍｉＲ３１９ａ前体序列的进化树分为两大分支，第－分支含有１０个??物种，第二分支也侖１０个物种。其中梅和桃亲缘关系最近，其次是玉米和苜蓿，香瓜和蓖??麻。苹果与香瓜、蓖麻和无油樟亲缘关系较近与拟南芥亲缘关系较远。这些都说明了??ｍｉＲ３１９ａ在进化关系上具有种间差异性。??２７??
、．：Ｉ??Ｂ?？?＾??＾?，—＇、、??图３－１?‘大嵌蒂’花芽总ＲＮＡ提取??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｆｒｏｍ?ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄｓ??２．２靶基因克隆及序列分析??根据预测的靶基因Ｐｍ－ｒｃ／＾序列分析，设计含有开放阅读框（ＯＲＦ）的特异引物，??以梅品种‘大嵌蒂’?ＣＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，将获得的特异片段进行切胶回收、??连接、转化、筛选阳性克隆和ＰＣＲ检测，５个阳性菌液公司测序，５个测序结果相同（图??３－２）。测序结果去掉非编码序列，显示靶基因片段大小为１３２０ｂｐ?（图３－３），编码４３９??个氨基酸，与梅基因组上预测的序列相似度９９．０９％。分析结果显示，Ｐｗ－７ｒ７＾序列包??含完整的开放式阅读框，以ＡＴＧ为起始密码子，以ＴＡＡ为终止密码子。??＼｜：＜１００??图３－２尸／７７－ＴＴ／Ｖ基因ｃＤＮＡ片段??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２?Ｐｍ－ＴＣＰ４?ｇｅｎｅ?ｃＤＮＡ?ｆｒ
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