不同花色万寿菊色素含量及类胡萝卜素代谢途径关键酶基因表达分析

发布时间：2020-11-19 02:23

　　 万寿菊(Tagets erecta L.)舌状花是提取叶黄素(Lutein)的优质植物源材料,其花色差异形成机理研究具重要意义。本论文以‘猩红色’万寿菊(‘Scarletade’)和‘非洲’万寿菊(‘Marigold African’)(分别简称为‘2013-1’和‘2013-2’)舌状花为试验材料,采用高效液相色谱(HPLC)法检测2个不同花色万寿菊4个时期(S1期,未开花蕾;S2期,半开花蕾;S3期,开放的头状花序;S4期,完全开放的头状花序)类胡萝卜素色素含量变化,Real-time PCR分析其生物合成与降解相关酶基因的表达特性,并利用同源克隆从万寿菊中获得类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD1和CCD4b,探讨万寿菊舌状花类胡萝卜素代谢关键酶基因及花色形成差异的机理,研究结果如下:1万寿菊舌状花类胡萝卜素色素含量分析HPLC技术检测分析万寿菊舌状花4个发育时期番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄素和叶黄素的含量,结果表明:(1)2个品种舌状花4个不同发育时期均检测出叶黄素、玉米黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素4种代谢产物,而番茄红素仅在‘2013-1’品种中检出,表明2个品种均含有叶黄素及玉米黄素的2个代谢分支途径。(2)2个品种中5种类胡萝卜素含量‘2013-1’均高于或显著高于‘2013-2’,其中β-胡萝卜素含量显著高于其它4种色素。在‘2013-1’品种S3期β-胡萝卜素含量显著低于其它3个时期,玉米黄素则最高且显著高于其它时期;叶黄素S1期显著低于其它3个时期,推测舌状花4个时期的外观颜色变化可能与玉米黄素、叶黄素和β-胡萝卜素含量变化有关。‘2013-2’品种β-胡萝卜素含量极显著高于其它4种色素,且4个时期呈现先高后低的变化趋势,叶黄素4个时期无显著差异,α-胡萝卜素和玉米黄素含量均低,未检测出番茄红素。2万寿菊舌状花类胡萝卜素合成相关基因的表达分析采用Real-time PCR分析类胡萝卜素代谢途径所有生物合成相关酶基因,结果如下:(1)主通路5个基因表达分析结果显示,PSY、CRTISO和Z-ISO 3个基因表达量变化趋势与花色变化基本一致,但浅黄色‘2013-2’品种表达量均较深橙色‘2013-1’品种高;‘2013-1’中ZDS表达量S1期低于或显著低于其它3个时期,且与番茄红素含量呈高度正相关,‘2013-2’ZDS表达量在S4期最高并显著高于其它3个时期,但未检测出番茄红素;2个品种PDS-1表达量是PDS-2的10倍,在‘2013-2’PDS-2表达量除S1期外,极显著高于‘2013-1’,而在‘2013-1’PDS-1高于或极显著高于‘2013-2’。(2)玉米黄素支路中ZEP和NXS均在S3,S4期表达量较高,且2个品种之间存在显著或极显著差异,并与花色变化趋势基本一致,可能是2个万寿菊品种花色差异形成的关键因素;CHYB变化趋势2个品种4个时期无明显规律但与前人报道结果不同。(3)叶黄素支路中2个品种LCYe 4个时期变化差异不显著,但与叶黄素含量变化趋势基本一致,在‘2013-1’中两者呈极显著高度相关,推测LCYe可能是叶黄素合成关键酶基因;2个品种CYP97A表达水平在S3期最高,并且该基因表达量与叶黄素含量变化呈中度相关或高度正相关,推测CYP97A可能是叶黄素合成关键酶基因。3万寿菊舌状花类胡萝卜素降解相关酶基因的表达分析(1)CCD家族利用Real-time PCR方法检测万寿菊花蕾转录组的7个CCD在2个品种4个不同时期基因表达量。结论如下:‘2013-1’CCD1 S1和S3期表达量最低,S4期极显著高于其它时期,‘2013-2’CCD1相对表达量整体高于‘2013-1’且S3期存在极显著差异,‘2013-1’CCD4a相对表达量与花色变化基本一致,但‘2013-2’品种则无明显关系,2个品种CCD4b表达量S3和S4期均显著高于前2个时期,CCD7在‘2013-2’4个时期表达量显著高于‘2013-1’,而NCED2、NCED3和NCED5在‘2013-1’表达量显著高于‘2013-2’,推测CCD1和CCD4b可能是2个万寿菊品种花色差异形成的关键酶基因。(2)其它降解相关酶基因CCS在‘2013-2’中与β-胡萝卜素含量变化趋势基本一致,但在‘2013-1’无明显相关性,推测其在‘2013-2’中可能与β-胡萝卜素的生物合成有一定相关性。4 CCD基因克隆分析(1)克隆获得万寿菊CCD1基因(Gen Bank登陆号:KX557488)的c DNA全长序列为1 746 bp,编码区长度1 623 bp,推测编码541个氨基酸;蛋白质分析表明Te CCD1为不稳定蛋白,不含信号肽,属RPE65超家族(登录号:PF03055),包含CCD家族保守结构域,主要定位于细胞质;万寿菊CCD1核酸序列与除虫菊CCD1基因同源性最高,为89%;氨基酸序列分析表明万寿菊CCD1与除虫菊同源性可高达93%,与其它19个不同种属CCD1同源性在75%—83%之间,表明是Te CCD1是高度保守的基因;系统进化树分析显示Te CCD1的进化基本符合植物分类学的进化规律,并具有明显的种属特征,万寿菊与菊科同源基因亲缘关系最近。(2)利用同源基因克隆获得CCD4b(Gen Bank登录号:KY450708),序列分析表明Te CCD4b c DNA全长序列为1 725 bp,编码区长度1 392 bp,推测编码463个氨基酸;编码的蛋白质Te CCD4b功能主要定位于质体膜,属RPE65超家族,包含CCD家族保守的结构域;同源分析表明Te CCD4b与向日葵Ha CCD4-L、案头菊Cm CCD4b同源性最高;系统进化树分析显示Te CCD4b与Ha CCD4-L和Cm CCD4b亲缘关系最近,与其它不同物种的CCD4和CCD4a存在差异,表明Te CCD4b在进化过程中保守性不强,且进化基本符合植物分类学的进化规律,不同种属之间具有明显差异。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S681.9
【部分图文】：

图 2-1 2 个万寿菊品种舌状花 4 个发育时期1-4 分别为‘2013-1’舌状花 S1、S2、S3 和 S4 期5-8 分别为‘2013-2’舌状花 S1、S2、S3 和 S4 期Fig.2-1 The developmental stages of Ray floret of two marigold varieties1-4：S1、S2、S3 and S4 stage of ray floret in ‘2013-1’;5-8: S1、S2、S3 and S4 stage of ray floretin ‘2013-2’2.1.2.2 标准品溶液的配制玉米黄素和叶黄素标准品用甲醇溶解，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素标准品用甲基叔丁基醚溶解，番茄红素标准品用正己烷溶解，除玉米黄素配成浓度为 50μg/mL，其余 4 种均配成 500 μg/mL 储存液。2.1.2.3 色谱条件向旋蒸干的类胡萝卜素样品，加入 1 mL 正己烷，溶解后用有机滤膜（直径 0.22 μm）过滤，上样 200 μL，进样 60 μL；

番茄红素在本研究中的保留时间为 22.31min、24.11 min、30.82 min、32.20 min和 45.57 min，提取液出峰色谱图（见图 2-1、图 2-2）。图2-1 类胡萝卜素标准样品出峰时间色谱图Fig.2-1 Chromatograms of carotenoid standard sample of different rentention times22.31min：叶黄素，24.11 min：玉米黄素，30.82 min：α-类胡萝卜素，32.20 min：β-类胡萝卜素，45.57 min：番茄红素22.31min: Lutein, 24.11 min: Zeaxanthin, 30.82 min:α-carotene, 32.20 min: β-carotene

上海交通大学硕士学位论文13图2-2 万寿菊类胡萝卜素提取物液相色谱图Fig.2-2 Chromatograms of carotenoids extraction of different rentention times22.07 min：叶黄素，24.33 min：玉米黄素，31.22 min：α-类胡萝卜素，32.12 min：β-类胡萝卜素，46.07 min：番茄红素22.07 min: Lutein, 24.33 min:Zeaxanthin, 31.22 min:α-carotene, 32.12 min: β-carotene,46.07 min: Lycopene2.2.2 花发育过程中类胡萝卜素色素含量变化图 2-3、2-4、2-5、2-6 和 2-7 显示万寿菊‘2013-1’和‘2013-2’品种舌状花 4 个不同发育时期叶黄素、玉米黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和番茄红素的含量及变化，2 个品种花发育过程均检出叶黄素、玉米黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素4 种代谢产物，番茄红素在‘2013-1’品种中检出，表明 2 个品种代谢途径均含有叶黄素及玉米黄素的 2 个分支途径。5 种类胡萝卜素含量‘2013-1’均高于‘2013-2’
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本文编号：2889558