梨重组S-RNase蛋白对花粉管生长的影响及花粉SFBBs基因的挖掘

发布时间：2020-11-19 23:37

　　 自交不亲和(Self-Incompatibility,SI)是普遍存在显花植物中防止近亲繁殖、促进遗传变异一种典型机制。梨(Pyrus)属于蔷薇科的苹果亚科,是我国重要的经济果树,其坐果结实受到配子体型自交不亲和(Gametophytic Self-Incompatibility,GSI)的调控。自花授粉后,受花柱S-RNase影响,花粉管仅能生长至花柱的1/3处,无法完成授粉授精过程,导致结果率很低。GSI由SI雌蕊决定因子S-RNase控制。S-RNase已经被证实可以编码RNase蛋白,该蛋白具有与细胞毒素相似的功能,可以特异性的抑制自我花粉管的生长,阻止近亲繁衍。SFBBs是候选SI花粉决定因子,其具有F-box结构域,可以通过形成SCF复合体降解S-RNase蛋白,促进异花授粉结实。目前的研究表明,S位点中一般包含多个花粉SFBBs基因,例如S4位点分离出6个花粉SFBBs基因,S2位点分离出10个花粉SFBBs基因。目前,在鸭梨S21与S34中仅分别报道了 3个和4个花粉SFBBs基因,还有诸多未知的花粉SFBB基因等待发现。另外,S-RNase作用机制还不清楚,而原核表达纯化S-RNase可以加速相关研究进展。本文采用体外表达技术,纯化出鸭梨的两种S-RNase,并分析了这两种重组S-RNase对花粉管生长的影响。另外,我们通过构建基因组文库的方式,在鸭梨的S位点挖掘未知的鸭梨SFBBs基因。主要结果如下:1.确认体外表达S-RNase抑制花粉管生长。原核表达的S-RNase蛋白具备与花柱S-RNase蛋白一样的功能,可以抑制花粉管生长。添加重组蛋白培养4 h后,均与对照组存在显著性差异。添加单种重组蛋白,其花粉管长度约为对照的一半,而添加两种重组蛋白的花粉管长度为对照组的1/3。2.筛选出重组S-RNase调控的基因。在重组蛋白处理的花粉转录数据中,共发现14个差异基因。这些基因的功能主要包括碳水化合物的运输和新陈代谢、翻译后修饰,复制,重组和修复、翻译后修饰,蛋白质周转和伴侣蛋白、无机离子转运和代谢、胞内运输分泌和囊泡运输。其中发现三个可能与ROS产生相关的上调基因(Pbr028631、Pbr03131P和Pr034143)和一个可能参与S-RNase在体内转运的下调基因(Pbr039542)。3.筛选出6个新的SFBBs基因。从构建的基因组文库中找到7个在花粉中均有高量表达的F-box基因。序列对比与聚类分析的结果显示,其中有6个F-box基因可能为SSFBB基因,而Pbr037090的表达量低于各个基因,且其含有一段其他SFBB价没有的核苷酸序列,推测其可能不是SFBBs基因,可能为SLFL。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S661.2
【部分图文】：

．以鸭梨花柱ｃＤＮＡ为模板，分别扩增了幻（ＡＹ２５０９８９．３?）和??（ＤＱ４１４８１３．１）的ＣＤＳ区域。通过琼脂糖凝胶电泳检测，两个基因的大小在７５０ｂｐ附近，??合预期大小，且均为单一特异性条带（图３－１）。将两个条带分别回收纯化之后，与载体??粒ｐＣｏｌｄ－ＴＦ同时进行双酶切并分别回收纯化片段。将目的片段分别与ｐＣｏｌｄ－ＴＦ载体连??转化后，在Ａｍｐ抗性平板上挑选菌落。每个重组质粒挑选单克隆进行验证，其中空载菌??约为２５０?ｂｐ，而正确连接的单克隆约为１?ｋｂ左右。如图３．１所示，幻Ｍ此的重组质??中共有３个阳性克隆，幻的重组质粒有４个阳性克隆。??为了避免假阳性，分别挑选两个阳性克隆过夜摇菌，提取质粒后进行双酶切验证，以??Ｃｏｌｄ－ＴＦ环状质粒作阳性对照。凝胶图约为５．８?ｋｂ位置为酶切过的载体质粒，７５０?ｂｐ附近??目的条带大小。四个质粒都切出了两个条带，上方条带与质粒ＤＮＡ大小相当，下方条??大小与ＰＣＲ产物大小相一致，说明这些质粒都已经被正确构建。将筛选的阳性克隆送至??工生物公司进行ｓａｎｇｅｒ测序，测序结果经过对比，与ＮＣＢ丨中登陆的幻的??ＤＳ区域完全匹配，可以进行下一步的原核表达。??

２５０ｂｐ??（ｃ）??图２．１?５２１－ＲＮａｓｅ和Ｓ３４－ＲＮａｓｅ的重组质粒构建??（ａ）：?６２１／５３４－ＲＮａｓｅＣＤＳ区域ＰＣＲ产物；（ｂ）：重组质粒的酶切鉴定；（ｃ）：重组质粒的ＰＣＲ筛选。??Ｍ：?ＭａｒｋｅｒＤ２０００?（Ｔｉａｎｇｅｎ）；?Ｓ２１：?Ｓ２１－ＲＮａｓｅ；?Ｓ３４：?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｆｏｒ?．Ｓ２１－ＲＮａｓｅ?ａｎｄ?５３４－ＲＮａｓｅ．?（ａ）：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ??Ｓ２１－ＲＮａｓｅ?ａｎｄ?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ?ＣＤＳ?ｒｅｇｉｏｎｓ；?（ｂ）：?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ；?（ｃ）：?ＰＣＲ??ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ．?Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?Ｄ２０００?（Ｔｉａｎｇｅｎ）；?Ｓ２１：?Ｓ２１－ＲＮａｓｅ；?３４：?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ??

然后使用４０?ｍＭ浓度的咪唑对非特异性吸附的杂蛋白进行洗涤，并使用２５０??ｍＭ浓度的咪唑进行洗脱收集。??从图２．４中可以看出，泳道１和２以及泳道４和５中的蛋白杂带很多，虽然含有一定??量的目的蛋白，但从洗脱的情况（泳道３和泳道６）来看，目的条带较为清晰明亮，且杂??蛋白浓度远远低于目的蛋白。可将洗脱的蛋白进行脱盐、浓缩，并用甘油保存重组ｇＲＮａｓｅ??蛋白。??
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本文编号：2890599