芒果GGPPS基因的克隆及其与果肉类胡萝卜素合成相关性的研究

发布时间：2020-11-20 22:14

　　 芒果果肉中含有类胡萝卜素、叶绿素等烯萜类物质,它们赋予了芒果丰富的营养价值和果实颜色。香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS)是类胡萝卜素等烯萜类物质代谢的关键限速酶,其产物GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate)是类胡萝卜素等下游代谢物质的共同前体。本研究以金煌、贵妃、椰香、红玉和台农的果肉为研究材料,采用生理学、生物化学、分子生物学的相关技术,研究GGPPS基因对后熟过程中果肉类胡萝卜素积累的调控机制。取得以下研究结果。1.采用RACE技术,从芒果果肉中克隆了 GGPPS基因,其cDNA理论全长为1247 bp,开放阅读框全长为1113bp,编码369个氨基酸。该基因与蔷薇GGPPS(AAM21639.1)氨基酸序列同源性为78%,氨基酸序列分析表明该序列含有两个DDx(2-4)D保守基元(FARM和SARM)和一个CxxxC基元,聚类结果表明此基因与其它物种的GGPPS大亚基聚在一起,故推测其在芒果中编码GGPPS大亚基,因此命名为MinGGPPSlsu。基因结构分析表明,MinGGPPSlsu没有内含子。构建亚细胞定位质粒瞬时转化烟草叶片,通过实时共聚焦显微镜观察该基因定位于叶绿体。采用RACE技术,从芒果果肉中克隆了GGPP 基因,其cDNA理论全长为1298bp,开放阅读框全长为1005bp,编码333个氨基酸。与近缘物种印楝GGPPSssu(KM108317)氨基酸序列同源性为83%,该基因氨基酸序列含有一个DDx(2-4)D保守基元和一个CxxxC基元,聚类时此基因与其它物种的GGPPS小亚基聚在一个显著的独立枝,故推测其在芒果中编码GGPPS小亚基,因此命名为MinGGPPSssu。基因结构分析表明,MinGGPPSssu有515bp的内含子。构建亚细胞定位质粒瞬时转化烟草叶片,通过实时共聚焦显微镜观察该基因定位于叶绿体。2.选择金煌、贵妃、椰香、红玉和台农的未熟果和成熟果为材料,通过基因表达量和总类胡萝卜素的测定,结果表明这5个品种的成熟果果肉中MinGGPPSlsu的表达量和总类胡萝卜素的含量均远远高于未熟果果肉。以成熟果果肉颜色差异较大的红玉和椰香的成熟过程的6个阶段的果肉为实验材料,通过基因表达量和类胡萝卜素的测定与相关性分析,结果表明两个品种的6个阶段的MinGGPPSlsu的表达量与总类胡萝卜素的含量显著正相关,MinGGPPSssu的表达量与类胡萝卜素的含量不相关。暗示MinGGPPSlsu在果肉后熟过程中参与类胡萝卜素的合成,其作用机理有待于进一步研究。3.椰香果实成熟过程中果肉颜色由白转橙,红玉果实成熟过程中果肉颜色由白转黄。通过高效液相色谱法对β-胡萝卜素和番茄红素检测,结果如下:椰香和红玉果实成熟过程的六个阶段果肉中的β-胡萝卜素均呈上升趋势且与MinGGPPSlsu表达量正相关,同阶段椰香果肉中的β-胡萝卜素普遍高于红玉;椰香在阶段5和6检测到番茄红素,红玉中没有检测到番茄红素。本研究初步揭示了 GGPPS基因对后熟过程中果肉类胡萝卜素积累的影响。通过对芒果GGPPS的研究为果肉类胡萝卜素的积累提供实验支持,并为生产上芒果果实成熟期与类胡萝卜素等烯萜类物质的调控提供理论依据。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S667.7
【部分图文】：

图２－４：设计片段扩增引物??Ｆｉｇ２－４：?Ｄｅｓｉｇｎ?ｏｆ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｉｍｅｒｓ??注：５’端的Ｎ代表任意碱基。方框里为任意选择的粘性末端。红字为ｇＲＮＡ片段的反向互补序列。??３’末端小写字母为退火ｇＲＮＡ正向引物或者ｔＲＮＡ反向引物。??Ｎｏｔｅ：?Ｔｈｅ?ｔ＇ｖｏ?５’－ｔｅｒｍｉｎａｌ?ｂａｓｅｓ?（ｓｈｏｗｎ?ｉｎ?ｌｏｗｅｒｃａｓｅ）?ａｒｅ?ｒａｎｄｏｍｌｙ?ａｄｄｅｄ?ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ?ｔｏ?ｅｎｈａｎｃｅ?Ｂｓａｌ??ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ．?Ｔｈｅ?ｒｅｄ?ｃｏｌｏｒ?ｉｎｄｉｃａｔｅｓ?ｔｈｅ?ｒｅｖｅｒｓｅ?ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｓｐａｃｅｒ．??Ｔｈｅ?ｌｏｗｅｒｃａｓｅ?ｌｅｔｔｅｒｓ?ａｔ?ｔｈｅ?３’￣ｅｎｄ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｂａｓｅｓ?ｔｈａｔ?ａｎｎｅａｌ?ｔｏ?ｇＲＮＡ?（Ｆｏｒｗａｒｄ?ｐｒｉｍｅｒ）?ｏｒ?ｔＲＮＡ??

图２－３：?ＧＧＰ／５基因编辑靶点示意图??Ｆｉｇ２－３：?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＧＧＰＰＳ?ｇｅｎｅ?ｅｄｉｔｉｎｇ?ｔａｒｇｅｔ??表外显子，细线代表内含子序列，剪刀符号为所选靶点依次为１－８??ｔｌｉｉｃｋ?ｌｉｎｅ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｅｘｏｎｓ，?ａｎｄ?ｔｌｉｅ?ｔｈｉｎ?ｌｉｎｅ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｉｎｔｒｏｎ．?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｓｃｉｓｓｏｒｓ?ｌｉｅ?ｓｅｌｅｃｔｅｄ?ｔａｒｇｅｔ?ｆｒｏｍ?１?ｔｏ?８??

为３０°Ｃ；进液量为２〇ｎＬ；梯度洗脱条件为０ｍｍ３０°／。流动相Ｂ，?１０ｍｉｎ３０％，?２０ｍｉｎ９０％流动相?Ｂ，?２５ｍｉｎ３０％流动相?Ｂ。??（３）标准曲线??取１０ｍｇ的卩－胡萝卜素标准品用丙酮定容到１００ｍＬ，配成１００｜ｘｇ／ｍＬ的母液。的番茄红素标准品用乙酸乙酯定容到２０ｍＬ，配成２〇ｎｇ／ｍＬ的母液。使用ＭＴ标准品。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线（如图２－１和２－２所示范围、相关系数、回归方程和检出限如表１所示。??表１番茄红素和Ｐ－胡萝卜素的线性范围、相关系数、回归方程、检出限??Ｔａｂｌｅ?１?Ｌｉｎｅａｒ，?ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，?ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｌｉｍｉｔ?ｏｆ?ｌｙｃｏｐｅｎｅ?ａｎｄ?（（－ｃａｒｏｔｅｎｅ??线性范围?相关系数?检出限??类胡萝卜素?回归方程?竹人１?乂?Ｔ／．??（＾ｇ／ｉｎＬ）?（Ｒ２）?（ｊｉｇ／ｍＬ）??Ｐ－胡萝卜素?９－７３?ｙ?＝?２２８．６１ｘ?＋８７．４５８?０．９９９６?０．０１??番茄红素?１－２０?ｙ?＝?２４７．２２ｘ＋?１０．５５５?０．９９９１?０．０２??
【参考文献】

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本文编号：2892065