分蘖洋葱化感相关基因的克隆及功能分析
发布时间：2021-01-04 14:31
随着设施栽培面积不断扩大,连作现象越来越严重,也成为了亟待解决的问题,而采用合理的轮、间、套作是解决蔬菜连作障碍的有效途径。本课题组多年的研究发现,设施栽培分蘖洋葱伴生番茄后,能有效地减轻番茄病害的发生,促进番茄植株的生长,产量增加58%。目前已有很多分蘖洋葱的化感作用分子机理的研究报道,而基因对分蘖洋葱化感作用的调控还尚不清楚。本研究以分蘖洋葱、番茄为试材,利用课题组前期通过的RNA-Seq高通量测序、表达谱DGE结果确定的与分蘖洋葱化感作用相关的两个基因Chi、Pal,采用分子克隆的方法进行3’RACE扩增,首次从分蘖洋葱中克隆得到Acad Chi、Acad Pal基因全长,构建了超表达载体转化到拟南芥中。研究验证基因相关功能,应用q RT-PCR、PCR-DGGE、Illumian Miseq测序技术等研究其对根区微生物群落分布及丰度、多样性的影响,验证了拟南芥根系分泌物对番茄的化感效应及对番茄黄萎病菌抑菌效应。旨在为揭示分蘖洋葱伴生番茄机理的研究提供理论依据,对研究分蘖洋葱化感作用及其在设施栽培的应用具有一定的指导意义。本研究的主要结论如下:1.采用荧光定...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
酚类物质的主要代谢途径Fig.1-1Mainmetabolicpathwayofphenolics1.2.3.2酚酸类物质对植物的影响
东北农业大学农学博士学位论文6图1-2 酚类化合物的基本分类Fig. 1-2 Basic classification of phenolic compounds酚类化合物在植物中有许多重要的生理功能，对植物的品质、产量等起着至关重要的作用。作为植物叶、茎、表皮、花、果实等器官的着色剂；酚类化合物对诸如伤害、侵染、光过剩或 UV 辐射等逆境胁迫有防御作用，起到保护植物的作用；作为细胞壁的结构成分，类黄酮和酚酸参与细胞壁的组成； 酚类化合物是植物化感作用的生化分子；酚类化合物还可以充当信号分子；一些类黄酮还是一些物种的雄性育性、抗微生物制剂、取食抑制剂、植物和固氮细菌间的起到支撑植物的作用识别信号。酚类物质对植物生长发育有一定的调节作用，其中一元酚会抑制植物的生长，而二元酚或多元酚对植物生长却有促进作用[70]。1.2.3.3 酚酸类物质对土壤微生物的影响土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤微生物多样性与活性的保持是农业生态系统健康、稳定的基础[71]。土壤微生物一方面在对促进植物生长、改善土壤结构、促进养分循环等方面起到重要作用[72]。另一方面，植物也会通过分泌根系分泌物、残茬分解等方式影响土壤微生物的活性和群落结构。酚酸物质能够抑制微生物产生气体与脂肪酸，并且可减少微生物对其生长介质的消耗[73]。根际微生物在分解有机物质的过程中
分蘖洋葱化感相关 Chi 基因的克隆与功能分析5 ×BP ClonaseTM 反应缓冲液 2 μl、BP ClonaseTM 酶混合物 1 μl, 补充 TE) 至 10 μl。反应体系置 25℃温育 2 h 后加入 2 μl 蛋白酶 K 溶液，37℃温育 BP 反应。将反应产物转化至 50μl E.coli DH 5α 感受态细胞中。转化后涂布含素的 LB 筛选培养基，37℃培养过夜。挑取单菌落至 5 ml 含 50 mg/l 卡那霉 培养基中，37℃ 培养过夜。2 LR 反应 反应的目的在于将已经重组入 Entry 载体的目标基因再克隆到表达载体 SO表达克隆。LR 反应体系中包括 Entry 克隆 100～300 ng、SOL2095 载体 1 μeTM 反应缓冲液 2 μl、LR ClonaseTM 酶混合物 1 μl，补充 TE 缓冲液 ( pH反应体系置 25℃ 温育 2 h 后加入 2 μl 蛋白酶 K 溶液，37℃ 温育 10 min应，载体构建图（见图 3-1）。 反应产物的转化及阳性克隆的鉴定将 LR 反应产物转化大肠杆菌菌株 DH 5对重组质粒进行测序鉴定，以确定是否构建到超表达载体中。
【参考文献】：
期刊论文
[1]白菜套作葱蒜对其产量及品质的影响[J]. 徐蕾,杨凤军,吴瑕,丁睿,鹿英杰,候柏新. 北方园艺. 2016(14)
[2]作物连作障碍的克服——难解的问题[J]. 李天来,杨丽娟. 中国农业科学. 2016(05)
[3]燕麦/大豆和燕麦/花生间作对根际土壤固氮细菌多样性与群落结构的影响[J]. 冯晓敏,杨永,任长忠,胡跃高,曾昭海. 中国农业大学学报. 2016(01)
[4]伴生分蘖洋葱对菜豆出苗、病害及产量的影响[J]. 刘守伟,赵索,吴凤芝,周新刚. 北方园艺. 2015(18)
[5]伴生小麦对黄瓜霜霉病发病及设施环境温度和湿度的影响[J]. 于高波,姜彤,闫龙祥,魏金鹏. 北京农业. 2015(23)
[6]间套作改善作物矿质营养的机理研究进展[J]. 付学鹏,吴凤芝,吴瑕,刘丹. 植物营养与肥料学报. 2016(02)
[7]分蘖洋葱伴生对番茄矿质养分吸收及灰霉病发生的影响[J]. 吴瑕,吴凤芝,周新刚. 植物营养与肥料学报. 2015(03)
[8]浅谈寒地毛葱高产栽培技术[J]. 刘桂萍,王建军. 农民致富之友. 2015(03)
[9]耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响[J]. 王丽娟,李刚,赵建宁,红雨,修伟明,王慧,章秋艳,杨殿林. 中国油料作物学报. 2013(06)
[10]油松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析[J]. 魏宁,樊军锋,杨培华,刘永红,刘春英. 西北林学院学报. 2013(03)
博士论文
[1]伴生分蘖洋葱调控番茄黄萎病抗性的机理研究[D]. 付学鹏.东北农业大学 2016
[2]转多基因库安托杨生态安全性评价及非预期效应研究[D]. 朱文旭.中国林业科学研究院 2015
[3]农杆菌介导的籼粳稻转化差异[D]. 铁韦韦.华中农业大学 2012
[4]银杏叶次生代谢产物的环境诱导机制及其调控[D]. 朱灿灿.南京林业大学 2010
[5]分蘖洋葱根系分泌物对黄瓜的化感作用及其应用[D]. 杨阳.东北农业大学 2010
[6]紫茎泽兰分子研究平台的建立及化感相关基因EaCHS1的克隆[D]. 郭惠明.中国农业科学院 2009
[7]紫茎泽兰群体遗传变异分析及化感作用相关基因的克隆[D]. 黄文坤.湖南农业大学 2007
[8]大蒜（Allium sativum L.）根系分泌物的化感作用研究及化感物质鉴定[D]. 周艳丽.西北农林科技大学 2007
[9]查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲类黄酮生物合成的调控[D]. 李凤霞.中国科学院研究生院（植物研究所） 2006
硕士论文
[1]OsMYB调节化感水稻抑草潜力变化的机制研究[D]. 钟永嘉.福建农林大学 2012
[2]苯丙氨酸解氨酶基因遗传转化水稻的研究[D]. 陈裕坤.福建农林大学 2011
[3]紫茎泽兰cDNA文库的构建及苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因家族的研究[D]. 裴熙祥.中国农业科学院 2009
[4]胡葱对番茄幼苗化感作用的研究[D]. 韩小燕.西南大学 2009
[5]设施番茄连作障碍的生态控制关键技术研究[D]. 吴彤东.苏州大学 2009
[6]丹参酚酸类成分生源合成的调控研究[D]. 肖莹.第二军医大学 2009
[7]不同轮套作方式对黄瓜产量及其根际土壤微生态环境的影响[D]. 于高波.东北农业大学 2009
[8]利用RNAi分析水稻化感作用关键酶PAL基因的功能[D]. 代小青.福建农林大学 2008
[9]紫茎泽兰细胞色素P450 CYP75基因的克隆与鉴定[D]. 王东兰.广西大学 2005
本文编号：2956929
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【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
酚类物质的主要代谢途径Fig.1-1Mainmetabolicpathwayofphenolics1.2.3.2酚酸类物质对植物的影响
东北农业大学农学博士学位论文6图1-2 酚类化合物的基本分类Fig. 1-2 Basic classification of phenolic compounds酚类化合物在植物中有许多重要的生理功能，对植物的品质、产量等起着至关重要的作用。作为植物叶、茎、表皮、花、果实等器官的着色剂；酚类化合物对诸如伤害、侵染、光过剩或 UV 辐射等逆境胁迫有防御作用，起到保护植物的作用；作为细胞壁的结构成分，类黄酮和酚酸参与细胞壁的组成； 酚类化合物是植物化感作用的生化分子；酚类化合物还可以充当信号分子；一些类黄酮还是一些物种的雄性育性、抗微生物制剂、取食抑制剂、植物和固氮细菌间的起到支撑植物的作用识别信号。酚类物质对植物生长发育有一定的调节作用，其中一元酚会抑制植物的生长，而二元酚或多元酚对植物生长却有促进作用[70]。1.2.3.3 酚酸类物质对土壤微生物的影响土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤微生物多样性与活性的保持是农业生态系统健康、稳定的基础[71]。土壤微生物一方面在对促进植物生长、改善土壤结构、促进养分循环等方面起到重要作用[72]。另一方面，植物也会通过分泌根系分泌物、残茬分解等方式影响土壤微生物的活性和群落结构。酚酸物质能够抑制微生物产生气体与脂肪酸，并且可减少微生物对其生长介质的消耗[73]。根际微生物在分解有机物质的过程中
分蘖洋葱化感相关 Chi 基因的克隆与功能分析5 ×BP ClonaseTM 反应缓冲液 2 μl、BP ClonaseTM 酶混合物 1 μl, 补充 TE) 至 10 μl。反应体系置 25℃温育 2 h 后加入 2 μl 蛋白酶 K 溶液，37℃温育 BP 反应。将反应产物转化至 50μl E.coli DH 5α 感受态细胞中。转化后涂布含素的 LB 筛选培养基，37℃培养过夜。挑取单菌落至 5 ml 含 50 mg/l 卡那霉 培养基中，37℃ 培养过夜。2 LR 反应 反应的目的在于将已经重组入 Entry 载体的目标基因再克隆到表达载体 SO表达克隆。LR 反应体系中包括 Entry 克隆 100～300 ng、SOL2095 载体 1 μeTM 反应缓冲液 2 μl、LR ClonaseTM 酶混合物 1 μl，补充 TE 缓冲液 ( pH反应体系置 25℃ 温育 2 h 后加入 2 μl 蛋白酶 K 溶液，37℃ 温育 10 min应，载体构建图（见图 3-1）。 反应产物的转化及阳性克隆的鉴定将 LR 反应产物转化大肠杆菌菌株 DH 5对重组质粒进行测序鉴定，以确定是否构建到超表达载体中。
【参考文献】：
期刊论文
[1]白菜套作葱蒜对其产量及品质的影响[J]. 徐蕾,杨凤军,吴瑕,丁睿,鹿英杰,候柏新. 北方园艺. 2016(14)
[2]作物连作障碍的克服——难解的问题[J]. 李天来,杨丽娟. 中国农业科学. 2016(05)
[3]燕麦/大豆和燕麦/花生间作对根际土壤固氮细菌多样性与群落结构的影响[J]. 冯晓敏,杨永,任长忠,胡跃高,曾昭海. 中国农业大学学报. 2016(01)
[4]伴生分蘖洋葱对菜豆出苗、病害及产量的影响[J]. 刘守伟,赵索,吴凤芝,周新刚. 北方园艺. 2015(18)
[5]伴生小麦对黄瓜霜霉病发病及设施环境温度和湿度的影响[J]. 于高波,姜彤,闫龙祥,魏金鹏. 北京农业. 2015(23)
[6]间套作改善作物矿质营养的机理研究进展[J]. 付学鹏,吴凤芝,吴瑕,刘丹. 植物营养与肥料学报. 2016(02)
[7]分蘖洋葱伴生对番茄矿质养分吸收及灰霉病发生的影响[J]. 吴瑕,吴凤芝,周新刚. 植物营养与肥料学报. 2015(03)
[8]浅谈寒地毛葱高产栽培技术[J]. 刘桂萍,王建军. 农民致富之友. 2015(03)
[9]耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响[J]. 王丽娟,李刚,赵建宁,红雨,修伟明,王慧,章秋艳,杨殿林. 中国油料作物学报. 2013(06)
[10]油松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析[J]. 魏宁,樊军锋,杨培华,刘永红,刘春英. 西北林学院学报. 2013(03)
博士论文
[1]伴生分蘖洋葱调控番茄黄萎病抗性的机理研究[D]. 付学鹏.东北农业大学 2016
[2]转多基因库安托杨生态安全性评价及非预期效应研究[D]. 朱文旭.中国林业科学研究院 2015
[3]农杆菌介导的籼粳稻转化差异[D]. 铁韦韦.华中农业大学 2012
[4]银杏叶次生代谢产物的环境诱导机制及其调控[D]. 朱灿灿.南京林业大学 2010
[5]分蘖洋葱根系分泌物对黄瓜的化感作用及其应用[D]. 杨阳.东北农业大学 2010
[6]紫茎泽兰分子研究平台的建立及化感相关基因EaCHS1的克隆[D]. 郭惠明.中国农业科学院 2009
[7]紫茎泽兰群体遗传变异分析及化感作用相关基因的克隆[D]. 黄文坤.湖南农业大学 2007
[8]大蒜（Allium sativum L.）根系分泌物的化感作用研究及化感物质鉴定[D]. 周艳丽.西北农林科技大学 2007
[9]查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲类黄酮生物合成的调控[D]. 李凤霞.中国科学院研究生院（植物研究所） 2006
硕士论文
[1]OsMYB调节化感水稻抑草潜力变化的机制研究[D]. 钟永嘉.福建农林大学 2012
[2]苯丙氨酸解氨酶基因遗传转化水稻的研究[D]. 陈裕坤.福建农林大学 2011
[3]紫茎泽兰cDNA文库的构建及苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因家族的研究[D]. 裴熙祥.中国农业科学院 2009
[4]胡葱对番茄幼苗化感作用的研究[D]. 韩小燕.西南大学 2009
[5]设施番茄连作障碍的生态控制关键技术研究[D]. 吴彤东.苏州大学 2009
[6]丹参酚酸类成分生源合成的调控研究[D]. 肖莹.第二军医大学 2009
[7]不同轮套作方式对黄瓜产量及其根际土壤微生态环境的影响[D]. 于高波.东北农业大学 2009
[8]利用RNAi分析水稻化感作用关键酶PAL基因的功能[D]. 代小青.福建农林大学 2008
[9]紫茎泽兰细胞色素P450 CYP75基因的克隆与鉴定[D]. 王东兰.广西大学 2005
本文编号：2956929
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