利用CRISPR/Cas9技术编辑甘蓝基因的初步研究
发布时间：2021-01-14 00:51
甘蓝（Brassica oleracea L.）是我国重要的蔬菜作物,每年栽培面积可达90万hm2,在蔬菜周年均衡供应中占有重要地位。甘蓝是典型的异花授粉植物,杂种优势明显。甘蓝具有自交不亲和特点使其繁殖需要采用蕾期人工授粉,费时费工、效率低、成本高,大大限制了雄性不育系在杂种优势育种中的应用。随着甘蓝自交不亲和遗传机制、控制自交不亲和性基因明确,以基因组编辑为主的反向遗传学技术可以对其关键基因进行精准改造,为培育自交亲和系提供了可能。其中CRISPR/Cas9技术的出现为精准修饰目的基因的实现提供了一套更加简便高效的研究方案。CRISPR/Cas9技术只对靶位点序列进行修饰,T0代植株中的表达载体序列可以通过后代自交分离获得不含任何外源DNA序列的非转基因植株,本质上和传统育种方法获得的突变体材料没有区别。一些国家对利用CRISPR/Cas9技术获得的农作物产品批准上市不受GMO条件约束。本研究利用这种“神奇”的基因组精准编辑技术精准敲除甘蓝BoPDS、SRK、BoGA4基因和烟草Nt PDS基因。另外,以烟草和甘蓝为对象,开展CRISPR/Cas9基因编辑体系的优化,以期获得更为简...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统作用机制示意图
第 1 章 文献综述在实际应用过程中，研究者将 tracrRNA/crRNA 二聚体改造成单一向导 RNA（Single guide RNA, sgRNA）[9]，改造后的 CRISPR/Cas9 系统主要由具有核酸内切酶功能的 Cas9 蛋白和具有引导作用的 sgRNA 两个主要元件组成，极大简化了基因组编辑技术的研究与应用。目前已报道利用 CRISPR 基因组编辑方法都是利用sgRNA-Cas9 体系进行切割 DNA 双链[16、17]。因此，CRISPR/Cas9 技术作用过程简单地表述为通过具有特异性向导的 sgRNA 序列与靶序列进行碱基互补配对，并引导 Cas9 蛋白结合到靶序列，进行 DNA 切割产生 DSBs（Double-strand DNA breaks,DSBs），从而激活细胞的非同源性末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源重组修复机制（Homologous recombination, HR），从而实现基因敲除、插入、替换等突变（图 1-2）。
ZFNs 技术特异性较低，效率不高，脱靶效应较明显，并且操作相对繁琐，昂贵。TALENs 技术特异性高，脱靶效应较低，也可以像 ZFNs 一样对基因组编辑，但是 TALEN 蛋白较大，表达载体构建较为困难。而 CRISPR/Cas9 相FNs 及 TALENs 具有更强大的优势，表现在载体构建简单易行，成本更低，可定点修饰多个靶位点，染色体大片段缺失，靶向效率更高，几乎任何分子生实验室都可以开展。上述特点使 CRISPR/Cas9 迅速替代了 ZFNs、TALENs 基辑技术，成为生物科学领域研究科学家的新宠。.4 DNA 断裂修复机制DNA 作为生命活动中最重要的遗传物质，调控各类蛋白质的合成，以保证机能正常运行。当外界环境变化造成 DNA 链断裂，又不能及时得到修复，将响生物体的正常生命活动，甚至导致生物体死亡。因此，细胞在长期的进化中形成了自身的修复机制。基因组编辑技术就是利用核酸内切酶产生 DNA 双裂经过修复机制以实现基因组的定向修饰，为人类创造所需的遗传变异体。，DNA 修复主要有两种方式：非同源性末端连接和同源重组修复机制（图 1-3）
本文编号：2975874
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas系统作用机制示意图
第 1 章 文献综述在实际应用过程中，研究者将 tracrRNA/crRNA 二聚体改造成单一向导 RNA（Single guide RNA, sgRNA）[9]，改造后的 CRISPR/Cas9 系统主要由具有核酸内切酶功能的 Cas9 蛋白和具有引导作用的 sgRNA 两个主要元件组成，极大简化了基因组编辑技术的研究与应用。目前已报道利用 CRISPR 基因组编辑方法都是利用sgRNA-Cas9 体系进行切割 DNA 双链[16、17]。因此，CRISPR/Cas9 技术作用过程简单地表述为通过具有特异性向导的 sgRNA 序列与靶序列进行碱基互补配对，并引导 Cas9 蛋白结合到靶序列，进行 DNA 切割产生 DSBs（Double-strand DNA breaks,DSBs），从而激活细胞的非同源性末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）或同源重组修复机制（Homologous recombination, HR），从而实现基因敲除、插入、替换等突变（图 1-2）。
ZFNs 技术特异性较低，效率不高，脱靶效应较明显，并且操作相对繁琐，昂贵。TALENs 技术特异性高，脱靶效应较低，也可以像 ZFNs 一样对基因组编辑，但是 TALEN 蛋白较大，表达载体构建较为困难。而 CRISPR/Cas9 相FNs 及 TALENs 具有更强大的优势，表现在载体构建简单易行，成本更低，可定点修饰多个靶位点，染色体大片段缺失，靶向效率更高，几乎任何分子生实验室都可以开展。上述特点使 CRISPR/Cas9 迅速替代了 ZFNs、TALENs 基辑技术，成为生物科学领域研究科学家的新宠。.4 DNA 断裂修复机制DNA 作为生命活动中最重要的遗传物质，调控各类蛋白质的合成，以保证机能正常运行。当外界环境变化造成 DNA 链断裂，又不能及时得到修复，将响生物体的正常生命活动，甚至导致生物体死亡。因此，细胞在长期的进化中形成了自身的修复机制。基因组编辑技术就是利用核酸内切酶产生 DNA 双裂经过修复机制以实现基因组的定向修饰，为人类创造所需的遗传变异体。，DNA 修复主要有两种方式：非同源性末端连接和同源重组修复机制（图 1-3）
本文编号：2975874
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