火龙果干旱响应miRNA/isomiR的克隆及靶基因验证

发布时间：2021-02-14 00:14

　　干旱作为植物生长所面临的逆境之一,被认为是导致作物减产的最主要原因。深度解析植物对干旱环境的响应机制,从而有效选育或创造出耐旱种质是解决农作物抗旱的有效措施。microRNA（miRNA）是一类由18至24个核苷酸组成的非编码RNA,在调控植物生长发育上发挥着重要作用,也参与了植物对非生物胁迫的响应。火龙果（Hylocereus）是原产于热带地区的仙人掌科植物,因其果实风味独特具有较高的营养价值,被南方高热量省份作为重要果树推广。作为仙人掌科植物,火龙果表现出极强的抗旱性。因此,全面认识火龙果响应干旱胁迫的分子调控机制,寻找干旱响应的关键基因,对筛选具有更好耐旱能力的火龙果种质及通过遗传改良提升其他植物的耐旱能力具有重要意义。前期工作中,本实验室通过抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）的方法对火龙果干旱响应的关键基因进行了挖掘。为解析火龙果在miRNA水平的干旱响应机制,本项目以本省主栽优质品种“紫红龙”（Hylocereus polyrhizus‘Zihonglong’）为试验对象,以肉质茎无性系作为试验材料,通过模拟逆境... 

【文章来源】：贵州大学贵州省 211工程院校

【文章页数】：289 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
植物学名表
第一章 前言
    1.1 植物miRNA
        1.1.1 植物miRNA的起源
        1.1.2 植物miRNA的生物合成
        1.1.3 作用方式和分子机理
    1.2 植物miRNA的研究方法
        1.2.1 序列的获得
        1.2.2 miRNA的鉴定
        1.2.3 miRNA定量方法
    1.3 植物miRNA的靶基因
        1.3.1 植物miRNA及其靶基因的保守性
        1.3.2 植物miRNA靶基因的预测
        1.3.3 植物miRNA靶基因的验证
    1.4 植物miRNA与非生物胁迫响应
    1.5 RT-qPCR内参基因的选择
        1.5.1 传统内参基因在非生物胁迫下的不稳定性
        1.5.2 扩增效率与基线设置在定量实验中的重要性
        1.5.3 非模式生物内参基因的选择及稳定性评估办法
        1.5.4 火龙果内参基因现状
第二章 火龙果在干旱逆境下的细胞生理学变化
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料及处理
        2.1.2 细胞生理指标的测定
    2.2 结果与分析
        2.2.1 干旱逆境对渗透调节物含量的影响
        2.2.2 干旱逆境对保护酶活性的影响
        2.2.3 干旱逆境对胞内水势、丙二醛含量和相对电导率的影响
        2.2.4 干旱逆境对气孔开放率的影响
    2.3 讨论
第三章 火龙果miRNA的预测及克隆
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试验材料及处理
        3.1.2 总RNA和 DNA的提取及检测
        3.1.3 sRNA的提取及检测
        3.1.4 转录组文库的构建及测序
        3.1.5 sRNA文库的构建及测序
        3.1.6 sRNA的克隆
        3.1.7 miRNA前体的克隆
        3.1.8 火龙果miRNA保守性分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 总RNA和 DNA的提取及检测
        3.2.2 测序数据及组装统计
        3.2.3 Unigene开放阅读框架预测
        3.2.4 Unigene功能注释
        3.2.5 sRNA的克隆
        3.2.6 miRNA的注释
        3.2.7 miRNA前体的序列及二级结构
        3.2.8 火龙果miRNA保守性分析
    3.3 讨论
        3.3.1 ShortStack在火龙果miRNA预测上的表现
        3.3.2 火龙果miRNA的克隆
        3.3.3 火龙果miRNA家族
        3.3.4 火龙果miRNA在不同植物中的保守性
第四章 火龙果miRNA靶基因的预测及验证
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料及处理
        4.1.2 总RNA的提取及检测
        4.1.3 miRNA结合位点的预测
        4.1.4 降解组文库的构建及测序
        4.1.5 miRNA结合位点RLM-5-RACE验证
        4.1.6 火龙果miRNA靶向关系保守性分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 总RNA的提取及检测
        4.2.2 miRNA结合位点的预测及PARE验证
        4.2.3 miRNA靶基因RLM-5-RACE验证
        4.2.4 miRNA结合位点保守性分析
    4.3 讨论
        4.3.1 三种算法在miRNA结合位点预测上的表现
        4.3.2 火龙果miRNA与转录因子
        4.3.3 火龙果miRNA靶向关系的保守性
第五章 火龙果miRNA对干旱逆境的响应
    5.1 材料与方法
        5.1.1 火龙果非生物胁迫下内参基因的筛选
        5.1.2 茎环法定量火龙果miRNA
    5.2 结果与分析
        5.2.1 火龙果非生物胁迫下内参基因的筛选
        5.2.2 茎环法定量火龙果miRNA
    5.3 讨论
        5.3.1 看家基因作为内参基因的不稳定性及对新内参基因的需求
        5.3.2 miRNA对干旱逆境的响应
第六章 火龙果isomiR的挖掘及靶基因预测
    6.1 材料与方法
        6.1.1 数据来源及前期处理
        6.1.2 isomiR的挖掘及特征分析
        6.1.3 火龙果功能性isomiR的挖掘及靶基因PARE预测
        6.1.4 茎环法定量火龙果isomiR
        6.1.5 Plant isomiR Atlas的构建
        6.1.6 Diff isomiRs的构建
    6.2 结果与分析
        6.2.1 isomiR的挖掘及鉴定
        6.2.2 功能性isomiR的挖掘及靶基因PARE鉴定
        6.2.3 Plant isomiR Atlas
        6.2.4 Diff isomiRs
    6.3 讨论
        6.3.1 火龙果isomiR序列特征
        6.3.2 isomiR参与的非生物逆境响应
        6.3.3 生物信息学数据库对植物isomiR研究的意义及影响
第七章 miRNA/isomiR参与的火龙果干旱响应
    7.1 miRNA参与的火龙果干旱响应
    7.2 isomiR辅助miRNA参与了火龙果的干旱响应反应
    7.3 创新点及展望
致谢
参考文献
附录
    附录 Ⅰ
        在校期间发表的文章
        在校期间参加的科研项目
    附录 Ⅱ
        附录1 克隆得到的miRNA前体结构及序列示意图
        附录2 已知miRNA家族成熟序列保守度
        附录3 miRNA结合位点降解事件
        附录4 火龙果miRNA结合位点保守度
        附录5 Plant isomiR Atlas所用sRNA数据
        附录6 Diff isomiRs所用sRNA数据
        附录7 non-templated isomiR碱基替换倾向性分析
        附录8 火龙果miRNA前体上的二联体
        附录9 isomiR结合位点降解事件


【参考文献】：
期刊论文
[1]干旱胁迫下H2S对板栗幼苗根系抗氧化特性及呼吸相关酶活性的影响[J]. 孙晓莉,田寿乐,沈广宁,姜倩倩,许林.  核农学报. 2019(05)
[2]干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种根系生长及生理特性影响[J]. 张翠梅,师尚礼,吴芳.  中国农业科学. 2018(05)
[3]干旱胁迫下不同品种草莓生理响应及抗旱性评价[J]. 张庆华,向发云,曾祥国,韩永超,过聪,顾玉成,陈丰滢.  北方园艺. 2018(02)
[4]小黑麦品系成株期抗旱性研究[J]. 李雪,田新会,杜文华.  核农学报. 2018(02)
[5]火龙果UQT和18s rRNA内参基因片段的克隆及表达分析[J]. 罗霞,文晓鹏.  山地农业生物学报. 2015(02)
[6]火龙果Actin及UBQ内参基因片段的克隆及序列分析[J]. 颜凤霞,文晓鹏,高国丽,陶金.  贵州农业科学. 2013(09)
[7]干旱胁迫对甘草幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响[J]. 李明,王根轩.  生态学报. 2002(04)



本文编号：3032803