金针菇与巨大口蘑原生质体融合育种研究
发布时间：2021-04-20 06:10
金针菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing]是著名的食用菌工厂化生产品种,其生长周期短,出菇产量高,且营养丰富,具有抗癌、防心脑血管疾病等功效。然而在工厂化栽培金针菇过程中由于低温控制所需能耗较大,企业运营成本增加。巨大口蘑（Tricholoma giganteum）是高温型食用菌品种,食药用价值高,贮藏性好且抗逆性强。但是由于其菌丝生长速度慢,出菇周期长,还无法全面普及市场;原生质体融合技术在食用菌领域上是一项重要的育种技术,相比于传统的杂交技术,它具有省时省力、目的性强等特点。本研究意在利用原生质体融合技术培育出能在中高温环境下生长出菇的金针菇新菌株和生长周期短的巨大口蘑新菌株。本研究对来源不同的金针菇和巨大口蘑菌株进行了亲本菌株的筛选,优势菌株原生质体经双亲灭活后利用PEG进行融合,最后获得与亲本有遗传差异性的菌株4株,采用分子生物学ISSR分析方法对其进行了鉴定,同时,还研究了它们的生物学特性。主要研究结果如下:1、亲本菌株的筛选。本研究以菌丝生长速度、原生质体产量和原生质体的单核化程度为指标,最终筛选确定JD03以及KD04作为原生质体融合的亲本菌株。...
【文章来源】：华南农业大学广东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 金针菇概述
1.1.1 金针菇的生物学特性
1.1.2 金针菇的产业现状
1.1.3 金针菇育种的研究进展
1.2 巨大口蘑概述
1.2.1 巨大口蘑的生物学特性
1.2.2 巨大口蘑产业现状
1.3 原生质体育种技术研究进展
1.3.1 原生质体育种技术简介
1.3.2 原生质体育种技术在食用菌领域的应用
1.3.3 食用菌原生质体的制备和再生
1.3.4 食用菌原生质体诱变技术
1.3.5 食用菌原生质体融合技术
1.3.5.1 化学融合法
1.3.5.2 物理融合法
1.3.6 原生质体融合标记技术
1.3.6.1 形态学标记
1.3.6.2 营养缺陷型标记
1.3.6.3 灭活原生质体标记
1.3.6.4 荧光染色标记
1.3.6.5 抗药性标记
1.3.6.6 其他标记方法
1.3.7 融合子的筛选鉴定
1.3.7.1 遗传标记的检测
1.3.7.2 融合子的生物学鉴定
1.4 本研究的内容、目的与意义
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究的目的与意义
1.5 技术路线图
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试菌株
2.1.2 基础培养基
2.2 主要仪器设备及试剂
2.2.1 主要仪器设备
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要试剂的配制
2.3 实验方法
2.3.1 菌株活化培养及生长速度测定
2.3.1.1 测定方法
2.3.1.2 金针菇及其单孢菌株菌丝生长速度的测定
2.3.1.3 巨大口蘑及其单孢菌株菌丝生长速度的测定
2.3.2 菌株原生质体制备及再生
2.3.2.1 金针菇菌丝液体培养
2.3.2.2 巨大口蘑菌丝液体培养
2.3.2.3 酶液的配制
2.3.2.4 测定方法
2.3.2.5 金针菇原生质体制备的步骤
2.3.2.6 巨大口蘑原生质体制备的步骤
2.3.3 原生质体单核化程度的测定
2.3.3.1 测定方法
2.3.3.2 金针菇原生质体单核化比例测定
2.3.3.3 巨大口蘑原生质体单核化比例测定
2.3.4 亲本的选择
2.3.5 金针菇与巨大口蘑原生质体融合工艺优化
2.3.5.1 融合方法
2.3.5.2 融合率的计算
2.3.5.3 试验设计
2.3.6 融合菌株的筛选
2.3.6.1 融合菌株的挑取与培养
2.3.6.2 菌落形态特征比较
2.3.6.3 融合菌株与亲本菌株的菌丝显微结构观察
2.3.6.4 拮抗实验
2.3.6.5 融合菌株与亲本菌丝生长速度比较
2.3.6.6 融合菌株与亲本袋栽培养生长速度比较
2.3.6.7 融合菌株与亲本液体发酵培养比较
2.3.7 融合菌株的ISSR鉴定
2.3.7.1 菌丝培养
2.3.7.2 液体发酵培养
2.3.7.3 基因组DNA的提取
2.3.7.4 基因组DNA电泳检测：
2.3.7.5 ISSR-PCR扩增及电泳
2.3.7.6 数据分析
2.3.8 融合菌株的生物学特性研究
2.3.8.1 测定方法
2.3.8.2 最适碳源筛选
2.3.8.3 最适氮源筛选
2.3.8.4 融合菌株母种培养基优化
2.3.8.5 融合菌株原种培养基筛选
3 结果与分析
3.1 金针菇及其单孢菌株菌丝生长速度比较
3.2 巨大口蘑及其单孢菌株菌丝生长速度比较
3.3 金针菇及其单孢菌株原生质体产量比较
3.4 巨大口蘑及其单孢菌株原生质体产量比较
3.5 原生质体单核化程度比较
3.5.1 金针菇及其单孢菌株原生质体单核化程度
3.5.2 巨大口蘑及其单孢菌株原生质体单核化程度
3.6 原生质体释放过程与方式
3.7 亲本的选择
3.8 金针菇与巨大口蘑融合工艺优化结果
3.9 原生质体融合观察
3.10 融合菌株的筛选
3.10.1 菌落形态观察
3.10.2 融合菌株与亲本菌株的菌丝显微结构观察
3.10.3 拮抗作用的观察
3.10.4 亲本及融合菌株生长速度比较
3.10.5 融合子袋栽培养生长速度比较
3.10.6 融合子与亲本液体发酵培养速度比较
3.10.7 融合菌株筛选结果
3.11 融合子的ISSR鉴定结果
3.11.1 融合子与亲本的ISSR分析
3.11.2 融合子与亲本的遗传相似系数
3.11.3 聚类分析
3.12 融合菌株生物学特性研究
3.12.1 融合菌株最适碳源选择
3.12.2 融合菌株最适氮源选择
3.12.3 融合菌株母种培养基优化结果
3.12.3.1 融合菌株R13母种培养基优化结果
3.12.3.2 融合菌株R14母种培养基优化结果
3.12.3.3 融合菌株R15母种培养基优化结果
3.12.4 融合菌株原种培养基的筛选结果
4 结论与讨论
4.1 结论
4.1.1 亲本的选择
4.1.2 金针菇与巨大口蘑原生质体融合最佳工艺
4.1.3 融合菌株的筛选与鉴定
4.1.3.1 融合菌株形态学观察
4.1.3.2 分子生物学鉴定
4.1.4 融合菌株生物学特性研究
4.1.4.1 融合菌株的平板培养基优化
4.1.4.2 融合菌株的原种培养基优化
4.2 讨论
4.2.1 原生质体的制备
4.2.2 亲本的选择
4.2.3 亲本灭活标记处理
4.2.4 原生质体的释放方式
4.2.5 融合子的筛选与鉴定
4.2.6 融合子的稳定性
4.3 创新之处及不足
4.4 展望
致谢
参考文献
【参考文献】：
期刊论文
[1]原生质体融合选育高产脂肽LI-F多粘类芽胞杆菌及融合菌株表达差异分析[J]. 闫冬,韩金志,别小妹,陆兆新,吕凤霞,赵海珍,张充. 生物工程学报. 2015(09)
[2]白色金针菇菌株脱毒复壮与栽培试验[J]. 王锋尖,周向宇,潘坤. 食用菌. 2015(04)
[3]金针菇的营养成分及药用价值[J]. 周萍,李新胜,马超,安东,王朝川,孟晓峰. 中国果菜. 2014(12)
[4]袋栽金针菇再生法工厂化生产技术[J]. 邢作山,郭惠,李洪忠,赖志斌,徐晖,李静. 西北园艺(蔬菜). 2014(06)
[5]金针菇原生质体制备和再生探究[J]. 陈鹏,郭成金. 江苏农业科学. 2014(09)
[6]植物病原菌产生的细胞壁降解酶种类和特性的概述[J]. 杨平. 农技服务. 2014(05)
[7]利用水稻原生质体快速分析miRNA靶标RNA[J]. 郭萍,武瑶,李嘉,方荣祥,贾燕涛. 生物工程学报. 2014(11)
[8]微生物原生质体融合育种技术及其应用研究进展[J]. 刘敏跃,李鹏,龙淼. 中国饲料. 2014(07)
[9]金福菇栽培培养基的优化研究[J]. 刘敏,郭苗,白志芳,王谦. 长江蔬菜. 2014(06)
[10]原生质体诱变技术在冬虫夏草优良菌株选育中的应用[J]. 马少丽. 安徽农业科学. 2013(36)
博士论文
[1]原生质体技术筛选刺芹侧耳高产多糖和漆酶菌株的研究[D]. 李艳丽.吉林农业大学 2012
[2]冬虫夏草原生质体育种及液体富Zn、Se、Ge研究[D]. 贾乐.山东农业大学 2006
硕士论文
[1]利用原生质体融合技术选育高产谷氨酰胺转胺酶茂原链霉菌菌株[D]. 侯孝仑.华东师范大学 2015
[2]基因组重排技术在草菇耐低温菌株选育上的应用[D]. 陈建中.上海海洋大学 2013
[3]原生质体融合构建纤维素发酵产油脂菌株的研究[D]. 张淑君.山东农业大学 2012
[4]木耳属遗传多样性及原生质体育种的研究[D]. 孙露.吉林农业大学 2012
[5]杏鲍菇与秀珍菇融合育种技术研究[D]. 张鹏.福建农林大学 2012
[6]木质素降解酶遗传转化体系在食用菌品种选育中的应用[D]. 李晓静.福建农林大学 2012
[7]双孢蘑菇单孢杂交育种及其遗传分析[D]. 弋淮.四川农业大学 2011
[8]冬虫夏草无性型原生质体制备及种群遗传多样性研究[D]. 肖岩岩.安徽农业大学 2011
[9]茯苓原生质体融合育种及其发酵动力学研究[D]. 刘宇邈.河南大学 2011
[10]真姬菇品种改良及其相关性研究[D]. 吴飞.福建农林大学 2011
本文编号：3149132
【文章来源】：华南农业大学广东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 金针菇概述
1.1.1 金针菇的生物学特性
1.1.2 金针菇的产业现状
1.1.3 金针菇育种的研究进展
1.2 巨大口蘑概述
1.2.1 巨大口蘑的生物学特性
1.2.2 巨大口蘑产业现状
1.3 原生质体育种技术研究进展
1.3.1 原生质体育种技术简介
1.3.2 原生质体育种技术在食用菌领域的应用
1.3.3 食用菌原生质体的制备和再生
1.3.4 食用菌原生质体诱变技术
1.3.5 食用菌原生质体融合技术
1.3.5.1 化学融合法
1.3.5.2 物理融合法
1.3.6 原生质体融合标记技术
1.3.6.1 形态学标记
1.3.6.2 营养缺陷型标记
1.3.6.3 灭活原生质体标记
1.3.6.4 荧光染色标记
1.3.6.5 抗药性标记
1.3.6.6 其他标记方法
1.3.7 融合子的筛选鉴定
1.3.7.1 遗传标记的检测
1.3.7.2 融合子的生物学鉴定
1.4 本研究的内容、目的与意义
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究的目的与意义
1.5 技术路线图
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试菌株
2.1.2 基础培养基
2.2 主要仪器设备及试剂
2.2.1 主要仪器设备
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要试剂的配制
2.3 实验方法
2.3.1 菌株活化培养及生长速度测定
2.3.1.1 测定方法
2.3.1.2 金针菇及其单孢菌株菌丝生长速度的测定
2.3.1.3 巨大口蘑及其单孢菌株菌丝生长速度的测定
2.3.2 菌株原生质体制备及再生
2.3.2.1 金针菇菌丝液体培养
2.3.2.2 巨大口蘑菌丝液体培养
2.3.2.3 酶液的配制
2.3.2.4 测定方法
2.3.2.5 金针菇原生质体制备的步骤
2.3.2.6 巨大口蘑原生质体制备的步骤
2.3.3 原生质体单核化程度的测定
2.3.3.1 测定方法
2.3.3.2 金针菇原生质体单核化比例测定
2.3.3.3 巨大口蘑原生质体单核化比例测定
2.3.4 亲本的选择
2.3.5 金针菇与巨大口蘑原生质体融合工艺优化
2.3.5.1 融合方法
2.3.5.2 融合率的计算
2.3.5.3 试验设计
2.3.6 融合菌株的筛选
2.3.6.1 融合菌株的挑取与培养
2.3.6.2 菌落形态特征比较
2.3.6.3 融合菌株与亲本菌株的菌丝显微结构观察
2.3.6.4 拮抗实验
2.3.6.5 融合菌株与亲本菌丝生长速度比较
2.3.6.6 融合菌株与亲本袋栽培养生长速度比较
2.3.6.7 融合菌株与亲本液体发酵培养比较
2.3.7 融合菌株的ISSR鉴定
2.3.7.1 菌丝培养
2.3.7.2 液体发酵培养
2.3.7.3 基因组DNA的提取
2.3.7.4 基因组DNA电泳检测：
2.3.7.5 ISSR-PCR扩增及电泳
2.3.7.6 数据分析
2.3.8 融合菌株的生物学特性研究
2.3.8.1 测定方法
2.3.8.2 最适碳源筛选
2.3.8.3 最适氮源筛选
2.3.8.4 融合菌株母种培养基优化
2.3.8.5 融合菌株原种培养基筛选
3 结果与分析
3.1 金针菇及其单孢菌株菌丝生长速度比较
3.2 巨大口蘑及其单孢菌株菌丝生长速度比较
3.3 金针菇及其单孢菌株原生质体产量比较
3.4 巨大口蘑及其单孢菌株原生质体产量比较
3.5 原生质体单核化程度比较
3.5.1 金针菇及其单孢菌株原生质体单核化程度
3.5.2 巨大口蘑及其单孢菌株原生质体单核化程度
3.6 原生质体释放过程与方式
3.7 亲本的选择
3.8 金针菇与巨大口蘑融合工艺优化结果
3.9 原生质体融合观察
3.10 融合菌株的筛选
3.10.1 菌落形态观察
3.10.2 融合菌株与亲本菌株的菌丝显微结构观察
3.10.3 拮抗作用的观察
3.10.4 亲本及融合菌株生长速度比较
3.10.5 融合子袋栽培养生长速度比较
3.10.6 融合子与亲本液体发酵培养速度比较
3.10.7 融合菌株筛选结果
3.11 融合子的ISSR鉴定结果
3.11.1 融合子与亲本的ISSR分析
3.11.2 融合子与亲本的遗传相似系数
3.11.3 聚类分析
3.12 融合菌株生物学特性研究
3.12.1 融合菌株最适碳源选择
3.12.2 融合菌株最适氮源选择
3.12.3 融合菌株母种培养基优化结果
3.12.3.1 融合菌株R13母种培养基优化结果
3.12.3.2 融合菌株R14母种培养基优化结果
3.12.3.3 融合菌株R15母种培养基优化结果
3.12.4 融合菌株原种培养基的筛选结果
4 结论与讨论
4.1 结论
4.1.1 亲本的选择
4.1.2 金针菇与巨大口蘑原生质体融合最佳工艺
4.1.3 融合菌株的筛选与鉴定
4.1.3.1 融合菌株形态学观察
4.1.3.2 分子生物学鉴定
4.1.4 融合菌株生物学特性研究
4.1.4.1 融合菌株的平板培养基优化
4.1.4.2 融合菌株的原种培养基优化
4.2 讨论
4.2.1 原生质体的制备
4.2.2 亲本的选择
4.2.3 亲本灭活标记处理
4.2.4 原生质体的释放方式
4.2.5 融合子的筛选与鉴定
4.2.6 融合子的稳定性
4.3 创新之处及不足
4.4 展望
致谢
参考文献
【参考文献】：
期刊论文
[1]原生质体融合选育高产脂肽LI-F多粘类芽胞杆菌及融合菌株表达差异分析[J]. 闫冬,韩金志,别小妹,陆兆新,吕凤霞,赵海珍,张充. 生物工程学报. 2015(09)
[2]白色金针菇菌株脱毒复壮与栽培试验[J]. 王锋尖,周向宇,潘坤. 食用菌. 2015(04)
[3]金针菇的营养成分及药用价值[J]. 周萍,李新胜,马超,安东,王朝川,孟晓峰. 中国果菜. 2014(12)
[4]袋栽金针菇再生法工厂化生产技术[J]. 邢作山,郭惠,李洪忠,赖志斌,徐晖,李静. 西北园艺(蔬菜). 2014(06)
[5]金针菇原生质体制备和再生探究[J]. 陈鹏,郭成金. 江苏农业科学. 2014(09)
[6]植物病原菌产生的细胞壁降解酶种类和特性的概述[J]. 杨平. 农技服务. 2014(05)
[7]利用水稻原生质体快速分析miRNA靶标RNA[J]. 郭萍,武瑶,李嘉,方荣祥,贾燕涛. 生物工程学报. 2014(11)
[8]微生物原生质体融合育种技术及其应用研究进展[J]. 刘敏跃,李鹏,龙淼. 中国饲料. 2014(07)
[9]金福菇栽培培养基的优化研究[J]. 刘敏,郭苗,白志芳,王谦. 长江蔬菜. 2014(06)
[10]原生质体诱变技术在冬虫夏草优良菌株选育中的应用[J]. 马少丽. 安徽农业科学. 2013(36)
博士论文
[1]原生质体技术筛选刺芹侧耳高产多糖和漆酶菌株的研究[D]. 李艳丽.吉林农业大学 2012
[2]冬虫夏草原生质体育种及液体富Zn、Se、Ge研究[D]. 贾乐.山东农业大学 2006
硕士论文
[1]利用原生质体融合技术选育高产谷氨酰胺转胺酶茂原链霉菌菌株[D]. 侯孝仑.华东师范大学 2015
[2]基因组重排技术在草菇耐低温菌株选育上的应用[D]. 陈建中.上海海洋大学 2013
[3]原生质体融合构建纤维素发酵产油脂菌株的研究[D]. 张淑君.山东农业大学 2012
[4]木耳属遗传多样性及原生质体育种的研究[D]. 孙露.吉林农业大学 2012
[5]杏鲍菇与秀珍菇融合育种技术研究[D]. 张鹏.福建农林大学 2012
[6]木质素降解酶遗传转化体系在食用菌品种选育中的应用[D]. 李晓静.福建农林大学 2012
[7]双孢蘑菇单孢杂交育种及其遗传分析[D]. 弋淮.四川农业大学 2011
[8]冬虫夏草无性型原生质体制备及种群遗传多样性研究[D]. 肖岩岩.安徽农业大学 2011
[9]茯苓原生质体融合育种及其发酵动力学研究[D]. 刘宇邈.河南大学 2011
[10]真姬菇品种改良及其相关性研究[D]. 吴飞.福建农林大学 2011
本文编号：3149132
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