植物成花途径关键基因AtLEAFY遗传转化露地菊及早花株系的筛选
发布时间：2021-04-23 13:04
露地菊（Chysanthemum morifolium）为菊科菊属多年生草本宿根植物,其株型矮壮,具有抗寒,抗旱,抗瘠薄,抗病虫,开花繁盛和管理粗放等特性,在园林绿化中占有重要地位。露地菊是典型的短日照植物,对光周期具有依赖性,花期大多集中在9月-10月,花期通常40-50天,在高纬度的寒冷的东北地区,露地菊能够正常繁殖生长,但盛花期恰遇霜冻期,植株受冻萎蔫使其观赏性明显下降、观赏期大幅缩短。为了满足观赏性和市场适应性对露地菊提早开花的要求,可以通过基因工程技术导入外源开花途径的相关基因,使其在露地菊中过量表达,从而达到改变花期的目的。因此,快速获得花期提前的转基因露地菊新品种具有重要的经济意义和推广价值。本试验以改良露地菊‘火焰’的花期出发点,借鉴已有报道的LEAFY基因不仅控制着花序分生组织向花分生组织的转变,而且具有调控开花时间的作用,利用分子生物学手段克隆拟南芥LEAFY基因及转基因相关技术操作,通过甘露糖筛选体系获得抗性植物,并进行后期相关分子实验鉴定,旨在获得花期提前的露地菊‘火焰’早花品系,从而可以为进一步研究和探讨露地菊成花诱导的分子机制打下良好的基础。本研究的主要结果...
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 植物成花途径的研究进展
1.1.1 光周期途径（Photoperiod pathway）
1.1.2 春化途径（Vernalization pathway）
1.1.3 自主途径（Autonomous pathway）
1.1.4 赤霉素途径（Gibberellic acid pathway）
1.1.5 年龄途径（Age Pathway）
1.1.6 环境温度通路（Ambient Temperature Pathway）
1.2 转基因技术在花卉育种中的重要作用
1.2.1 转基因菊花的研究现状
1.2.2 生物安全标记PMI基因在转基因技术中的应用
1.3 LEAFY基因的研究进展
1.3.1 LEAFY基因与花发育调控网络
1.3.2 LEAFY基因在复叶发育过程中的特殊性
1.4 本研究的目的和意义
2 拟南芥AtLEAFY基因克隆
2.1 试验材料
2.2 试验试剂
2.3 试验方法
2.3.1 拟南芥总RNA的提取
2.3.2 甲醛凝胶电泳拟南芥总RNA
2.3.3 反转录合成cDNA
2.3.4 以cDNA为模板,进行PCR扩增
2.3.5 PCR产物回收
2.3.6 PCR产物与载体的连接
2.3.7 重组转化E.coli及筛选
2.3.8 含有重组子的菌液的培养及菌液PCR检测目标基因
2.4 结果与分析
2.4.1 提取拟南芥RNA
2.4.2 拟南芥AtLEAFY基因克隆PCR电泳结果
2.4.3 测序结果
2.5 讨论
2.6 本章小结
3 拟南芥AtLEAFY基因过表达载体的构建
3.1 材料与试剂
3.2 试验方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 利用attB-LFY-F/R引物进行第一次PCR
3.2.3 利用attB-adapter-F/R进行第二次PCR
3.2.4 BP反应
3.2.5 LR反应
3.2.6 双酶切反应
3.3 结果与分析
3.3.1 attB-adaptor接头位点的引入
3.3.2 BP反应质粒转化鉴定
3.3.3 LR反应质粒转化鉴定
3.3.4 双酶切验证
3.4 讨论
3.5 本章小结
4 露地菊‘火焰’的遗传转化及抗性植株的获得
4.1 材料与试剂
4.1.1 试验材料
4.1.2 试验试剂
4.2 试验方法
4.2.1 pCAMBIA1301-PMI-AtLFY表达载体转化农杆菌
4.2.2 利用叶盘法进行遗传转化
4.2.3 抗性植株的获得
4.3 结果与分析
4.3.1 pCAMBIA1301-PMI-AtLFY表达载体转化农杆菌
4.3.2 露地菊‘火焰’甘露糖筛选阶段
4.4 讨论
4.5 本章小结
5 抗性植株的分子生物学鉴定
5.1 材料与试剂
5.1.1 试验材料
5.1.2 试验试剂
5.2 试验方法
5.2.1 露地菊‘火焰’抗性植株的PCR检测
5.2.2 初步鉴定的转基因植株GUS染色检测
5.2.3 Western Blot检测PMI蛋白
5.3 结果与分析
5.3.1 抗性植株的PCR检测
5.3.2 转基因植株GUS染色检测结果
5.3.3 Western Blot检测PMI蛋白结果
5.4 讨论
5.5 本章小结
6 转基因植株的表型鉴定
6.1 材料与试剂
6.2 试验方法
6.2.1 露地菊‘火焰’组培苗的炼苗与移栽
6.2.2 露地菊‘火焰’表型鉴定
6.3 结果与分析
6.3.1 转基因露地菊‘火焰’蕾期
6.3.2 转基因露地菊‘火焰’露红期
6.3.3 转基因露地菊‘火焰’始花期
6.3.4 转基因露地菊‘火焰’盛花期
6.3.5 野生型露地菊‘火焰’盛花期
6.3.6 转基因各株系花期统计
6.4 讨论
6.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]LEAFY（LFY）基因在花发育网络调控中的研究进展[J]. 张亚萍,习珺珺,于丽霞,李斌,高则睿,鄢波. 现代农业科技. 2012(09)
[2]菊花观赏性状和农艺性状基因工程改良研究进展[J]. 洪波,史春凤,张晓娇,高俊平. 中国农业科学. 2009(04)
[3]Ectopic expression of a hyacinth AGL6 homolog caused earlier flowering and homeotic conversion in Arabidopsis[J]. FAN JinHui1, LI WenQing2, DONG XiuChun1, GUO Wei1 & SHU HuaiRui3 1 College of Forestry, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2 College of Biological Science, China Agricultural University, Beijing 100094, China; 3 College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China. Science in China（Series C:Life Sciences）. 2007(05)
[4]拟南芥LEAFY基因在花发育中的网络调控及其生物学功能[J]. 王利琳,梁海曼,庞基良,朱睦元. 遗传. 2004(01)
[5]拟南芥LFY cDNA的克隆及转化菊花的研究[J]. 邵寒霜,李继红,郑学勤,陈守才. 植物学报. 1999(03)
本文编号：3155381
【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 植物成花途径的研究进展
1.1.1 光周期途径（Photoperiod pathway）
1.1.2 春化途径（Vernalization pathway）
1.1.3 自主途径（Autonomous pathway）
1.1.4 赤霉素途径（Gibberellic acid pathway）
1.1.5 年龄途径（Age Pathway）
1.1.6 环境温度通路（Ambient Temperature Pathway）
1.2 转基因技术在花卉育种中的重要作用
1.2.1 转基因菊花的研究现状
1.2.2 生物安全标记PMI基因在转基因技术中的应用
1.3 LEAFY基因的研究进展
1.3.1 LEAFY基因与花发育调控网络
1.3.2 LEAFY基因在复叶发育过程中的特殊性
1.4 本研究的目的和意义
2 拟南芥AtLEAFY基因克隆
2.1 试验材料
2.2 试验试剂
2.3 试验方法
2.3.1 拟南芥总RNA的提取
2.3.2 甲醛凝胶电泳拟南芥总RNA
2.3.3 反转录合成cDNA
2.3.4 以cDNA为模板,进行PCR扩增
2.3.5 PCR产物回收
2.3.6 PCR产物与载体的连接
2.3.7 重组转化E.coli及筛选
2.3.8 含有重组子的菌液的培养及菌液PCR检测目标基因
2.4 结果与分析
2.4.1 提取拟南芥RNA
2.4.2 拟南芥AtLEAFY基因克隆PCR电泳结果
2.4.3 测序结果
2.5 讨论
2.6 本章小结
3 拟南芥AtLEAFY基因过表达载体的构建
3.1 材料与试剂
3.2 试验方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 利用attB-LFY-F/R引物进行第一次PCR
3.2.3 利用attB-adapter-F/R进行第二次PCR
3.2.4 BP反应
3.2.5 LR反应
3.2.6 双酶切反应
3.3 结果与分析
3.3.1 attB-adaptor接头位点的引入
3.3.2 BP反应质粒转化鉴定
3.3.3 LR反应质粒转化鉴定
3.3.4 双酶切验证
3.4 讨论
3.5 本章小结
4 露地菊‘火焰’的遗传转化及抗性植株的获得
4.1 材料与试剂
4.1.1 试验材料
4.1.2 试验试剂
4.2 试验方法
4.2.1 pCAMBIA1301-PMI-AtLFY表达载体转化农杆菌
4.2.2 利用叶盘法进行遗传转化
4.2.3 抗性植株的获得
4.3 结果与分析
4.3.1 pCAMBIA1301-PMI-AtLFY表达载体转化农杆菌
4.3.2 露地菊‘火焰’甘露糖筛选阶段
4.4 讨论
4.5 本章小结
5 抗性植株的分子生物学鉴定
5.1 材料与试剂
5.1.1 试验材料
5.1.2 试验试剂
5.2 试验方法
5.2.1 露地菊‘火焰’抗性植株的PCR检测
5.2.2 初步鉴定的转基因植株GUS染色检测
5.2.3 Western Blot检测PMI蛋白
5.3 结果与分析
5.3.1 抗性植株的PCR检测
5.3.2 转基因植株GUS染色检测结果
5.3.3 Western Blot检测PMI蛋白结果
5.4 讨论
5.5 本章小结
6 转基因植株的表型鉴定
6.1 材料与试剂
6.2 试验方法
6.2.1 露地菊‘火焰’组培苗的炼苗与移栽
6.2.2 露地菊‘火焰’表型鉴定
6.3 结果与分析
6.3.1 转基因露地菊‘火焰’蕾期
6.3.2 转基因露地菊‘火焰’露红期
6.3.3 转基因露地菊‘火焰’始花期
6.3.4 转基因露地菊‘火焰’盛花期
6.3.5 野生型露地菊‘火焰’盛花期
6.3.6 转基因各株系花期统计
6.4 讨论
6.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]LEAFY（LFY）基因在花发育网络调控中的研究进展[J]. 张亚萍,习珺珺,于丽霞,李斌,高则睿,鄢波. 现代农业科技. 2012(09)
[2]菊花观赏性状和农艺性状基因工程改良研究进展[J]. 洪波,史春凤,张晓娇,高俊平. 中国农业科学. 2009(04)
[3]Ectopic expression of a hyacinth AGL6 homolog caused earlier flowering and homeotic conversion in Arabidopsis[J]. FAN JinHui1, LI WenQing2, DONG XiuChun1, GUO Wei1 & SHU HuaiRui3 1 College of Forestry, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2 College of Biological Science, China Agricultural University, Beijing 100094, China; 3 College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China. Science in China（Series C:Life Sciences）. 2007(05)
[4]拟南芥LEAFY基因在花发育中的网络调控及其生物学功能[J]. 王利琳,梁海曼,庞基良,朱睦元. 遗传. 2004(01)
[5]拟南芥LFY cDNA的克隆及转化菊花的研究[J]. 邵寒霜,李继红,郑学勤,陈守才. 植物学报. 1999(03)
本文编号：3155381
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3155381.html
