漾濞大泡核桃JsPRP1基因的克隆及功能分析

发布时间：2021-04-27 00:27

　　本研究基于对漾濞大泡核桃（Juglans sigillata,Dode）受胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染前后转录组测序产生的差异表达基因,根据编码富含脯氨酸蛋白（proline-rich protein,PRP）的EST序列,通过快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术从漾濞大泡核桃中克隆获得一个新的PRP基因JsPRP1,并对其进行生物信息学分析。采用荧光定量PCR （quantitative reverse transcriptase PCR,qRT-PCR）技术分析JSPRP1在漾濞大泡核桃叶片中的表达特性。构建JsPRP1基因的原核表达载体,诱导表达并纯化目的蛋白,检测重组目的蛋白的抗真菌活性。构建pBIN m-gfp5-ER-JsPRP1载体并转入根癌农杆菌Agrobacterium tumefacies)EHA105中,通过农杆菌介导侵染洋葱表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下,借助绿色荧光蛋白信号确定JsPRP1的亚细胞定位。同时将JSPRP1转入烟草（Nicotian... 

【文章来源】：昆明理工大学云南省

【文章页数】：102 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
    1.1 核桃
        1.1.1 核桃病害
        1.1.2 核桃转基因育种
    1.2 植物对炭疽病菌的抗性防卫机理研究
        1.2.1 分子抗病研究
        1.2.2 化学物质及代谢抗病研究
    1.3 植物富含脯氨酸蛋白
        1.3.1 富含脯氨酸蛋白的结构特征及分类
        1.3.2 富含脯氨酸蛋白基因的表达特性
            1.3.2.1 发育阶段和组织特异性表达
            1.3.2.2 对信号分子以及逆境胁迫的响应
        1.3.3 富含脯氨酸蛋白的功能
            1.3.3.1 维持细胞结构的稳定性
            1.3.3.2 参与植物对逆境胁迫的防卫反应
            1.3.3.3 其他功能
    1.4 脂质转移蛋白
    1.5 本课题的研究意义及目的
第二章 漾濞大泡核桃JsPRP1基因的克隆与表达特性分析
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 植物材料
        2.2.2 菌株和载体
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 缓冲液和培养基配方
    2.3 方法
        2.3.1 植物材料的处理及样品采集
        2.3.2 RNA的提取及mRNA的分离
        2.3.3 5’RACE及3’RACE
            2.3.3.1 RACE引物设计
            2.3.3.2 RACE cDNA第一链的合成
            2.3.3.3 RACE扩增
        2.3.4 T-A克隆
            2.3.4.1 DNA片段连接
            2.3.4.2 转化大肠杆菌
        2.3.5 全长cDNA的克隆及生物信息学分析
            2.3.5.1 全长cDNA序列的扩增
            2.3.5.2 生物信息学分析
        2.3.6 基因编码区序列扩增及内含子分析
            2.3.6.1 CTAB法提取基因组DNA
            2.3.6.2 编码区序列的扩增及内含子分析
        2.3.7 qRT-PCR
    2.4 结果与分析
        2.4.1 JsPRP1全长cDNA克隆及内含子分析
        2.4.2 生物信息学分析
            2.4.2.1 序列同源性分析
            2.4.2.2 理化性质
            2.4.2.3 信号肽及亚细胞定位分析
            2.4.2.4 跨膜结构预测
            2.4.2.5 二级结构分析
            2.4.2.6 多重序列比对和系统进化分析
            2.4.2.7 三维结构预测
        2.4.3 表达谱分析
    2.5 讨论
第三章 JsPRP1的原核表达及抑菌活性分析
    3.1 前言
    3.2 材料与试剂
        3.2.1 菌株和载体
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 缓冲液和培养基配方
    3.3 方法
        3.3.1 JsPRP1的扩增
        3.3.2 原核表达载体的构建
            3.3.2.1 质粒提取及纯化
            3.3.2.2 酶切反应
            3.3.2.3 胶回收
            3.3.2.4 DNA连接
        3.3.3 转化大肠杆菌感受态细胞
        3.3.4 His-JsPRP1融合蛋白的诱导表达
        3.3.5 外源蛋白的提取和纯化
        3.3.6 外源蛋白的超滤浓缩
        3.3.7 外源蛋白抑菌活性的测定
            3.3.7.1 真菌的预培养
            3.3.7.2 平板抑菌实验
    3.4 结果与分析
        3.4.1 JsPRP1原核表达载体的构建及转化
        3.4.2 JsPRP1的诱导表达
        3.4.3 融合蛋白的纯化
        3.4.4 融合蛋白的抑菌活性分析
    3.5 讨论
第四章 JsPRP1的亚细胞定位
    4.1 前言
    4.2 材料与试剂
        4.2.1 植物材料
        4.2.2 菌株和载体
        4.2.3 主要试剂
        4.2.4 缓冲液和培养基配方
    4.3 方法
        4.3.1 亚细胞定位载体的构建
        4.3.2 农杆菌EHA105感受态细胞的制备
2冻融法转化农杆菌EHA105感受态细胞">        4.3.3 CaCl₂冻融法转化农杆菌EHA105感受态细胞
        4.3.4 PCR反应
        4.3.5 农杆菌EHA105活化
        4.3.6 农杆菌EHA105侵染洋葱表皮
    4.4 结果与分析
        4.4.1 JsPRP1亚细胞定位载体的构建
        4.4.2 JSPRP1亚细胞定位载体转化根癌农杆菌
        4.4.3 JsPRP1-GFP融合蛋白的亚细胞定位
    4.5 讨论
第五章 JsPRP1在转基因烟草中的功能分析
    5.1 前言
    5.2 材料与试剂
        5.2.1 植物材料
        5.2.2 菌株和载体
        5.2.3 主要试剂
        5.2.4 缓冲液和培养基配方
    5.3 方法
        5.3.1 植物超表达载体的构建
        5.3.2 农杆菌LBA4404感受态细胞的制备
2冻融法转化农杆菌LBA4404感受态细胞">        5.3.3 CaCl₂冻融法转化农杆菌LBA4404感受态细胞
        5.3.4 PCR反应
        5.3.5 农杆菌LBA4404活化
        5.3.6 叶盘转化法
        5.3.7 转基因烟草的筛选
        5.3.8 转基因烟草中JsPRP1表达水平分析
        5.3.9 转基因烟草的非生物胁迫处理
        5.3.10 转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性分析
        5.3.11 数据处理
    5.4 结果与分析
        5.4.1 JsPRP1植物超表达载体的构建
        5.4.2 JsPRP1植物超表达载体转化根癌农杆菌
        5.4.3 JsPRP1转基因烟草的产生
        5.4.4 JsPRP1转基因烟草的筛选
        5.4.5 转基因烟草中JsPRP1的转录水平分析
        5.4.6 转基因烟草提高了对干旱和镉胁迫的耐受性
        5.4.7 转基因烟草的胶孢炭疽菌的耐受性
    5.5 讨论
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
致谢
参考文献
附录 攻读硕士学位期间发表论文
申请专利



本文编号：3162407