指状青霉MFS转运蛋白基因Pdmfs2的克隆及功能研究
发布时间：2021-04-29 13:33
指状青霉（Penicillium digitatum）是柑橘类水果的主要致病真菌,在采摘后的加工、贮藏、运输和销售过程中引起绿霉病而造成巨大损失。甾醇14a-脱甲基化酶抑制剂（DMIs）具有良好的杀真菌效果,但是抗药性菌株的出现使得绿霉病的防治更加复杂且困难。面对这种情况,研究病原真菌的DMIs抗性分子机理具有十分重要意义。对于DMIs抗性分子机制的深入理解为发现新的药物靶标及开发新型高效药物提供基础。MFS超家族蛋白（major facilitator superfamily）是普遍存在于整个生物界的一大类转运蛋白,具有非常广泛的生理功能。许多MFS转运蛋白的底物结合特异性较低,能够运输多种底物。研究发现,微生物中这类转运蛋白基因的过量表达可能导致多药抗性。本文克隆了指状青霉中一个新的MFS转运蛋白基因——-Pdmfs2 ,探讨了该基因与指状青霉对咪酰胺药物抗性之间的关系,并进一步研究了Pdmfs2的其它功能。主要研究结果如下：1、在指状青霉中发现了一个新的MFS超家族蛋白基因,命名为Pdmfs2。该基因全长2115 bp,在211-261 bp、333-388 bp、681-731...
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 DMIs类药物研究及真菌抗药性的产生
1.1.1 DMIs类药物研究
1.1.2 真菌抗药性的产生
1.2 真菌对DMIs类药物的抗性机制
1.2.1 CYP51与真菌抗药性
1.2.2 药泵蛋白与真菌抗药性
1.2.3 转录因子与真菌抗药性
1.3 MFS转运蛋白
1.3.1 MFS转运蛋白概述
1.3.2 MFS转运蛋白的结构
1.3.3 MFS转运蛋白的作用机理
1.4 本文研究内容及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 培养基
2.1.3 化学试剂及药品
2.1.4 工具酶与试剂盒
2.2 实验方法
2.2.1 真菌基因组DNA与总RNA的提取
2.2.2 Pdmfs2基因的克隆
2.2.3 基因及蛋白质序列分析
2.2.4 反转录与荧光定量(RT-PCR)
2.2.5 基因敲除质粒的构建
2.2.6 基因回补质粒的构建
2.2.7 农杆菌感受态细胞的制备及转化
2.2.8 指状青霉的遗传转化与转化子筛选
2.2.9 Southern blot分析
2.2.10 对于咪酰胺EC_(50)值测定
2.2.11 生长速率测定
2.2.12 产孢率测定
2.2.13 对于柑橘类水果侵染毒力测定
2.2.14 统计分析
3 结果与分析
3.1 Pdmfs2基因的克隆及序列分析
3.2 Pdmfs2的转录水平分析
3.3 Pdmfs2基因敲除及回补质粒构建
3.4 Pdmfs2突变菌株的筛选与分析
3.5 PdMFS2对于指状青霉咪酰胺抗性及生长速率的作用
3.6 PdMFS2影响指状青霉产孢率及致毒力
4 讨论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
衷心感谢以下基金资助
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]MFS超家族转运蛋白结构基础及转运机制[J]. 邓东,颜宁. 科学通报. 2015(08)
[2]植物病原真菌对甾醇生物合成抑制剂类（SBIs）杀菌剂的抗药性研究进展[J]. 叶滔,马志强,毕秋艳,牛芳胜,韩秀英,张小风,王文桥,张利辉. 农药学学报. 2012(01)
[3]植物内生真菌抗肿瘤药物研究进展(英文)[J]. 邱敏,谢瑞生,史彧,陈海敏. 中国生物工程杂志. 2009(01)
[4]农用杀菌剂作用机理的研究进展[J]. 刁春玲,刘芳,宋宝安. 农药. 2006(06)
[5]植物病原菌抗药性遗传研究[J]. 袁善奎,周明国. 植物病理学报. 2004(04)
[6]丝状真菌对甾醇生物合成抑制剂的抗性分子机制[J]. 李红叶,朱国念,朱金文,谢青云. 菌物系统. 2002(02)
[7]抑制麦角甾醇生物合成的杀菌剂抗性研究[J]. 周明国. 农药. 1987(01)
本文编号：3167623
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 DMIs类药物研究及真菌抗药性的产生
1.1.1 DMIs类药物研究
1.1.2 真菌抗药性的产生
1.2 真菌对DMIs类药物的抗性机制
1.2.1 CYP51与真菌抗药性
1.2.2 药泵蛋白与真菌抗药性
1.2.3 转录因子与真菌抗药性
1.3 MFS转运蛋白
1.3.1 MFS转运蛋白概述
1.3.2 MFS转运蛋白的结构
1.3.3 MFS转运蛋白的作用机理
1.4 本文研究内容及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 培养基
2.1.3 化学试剂及药品
2.1.4 工具酶与试剂盒
2.2 实验方法
2.2.1 真菌基因组DNA与总RNA的提取
2.2.2 Pdmfs2基因的克隆
2.2.3 基因及蛋白质序列分析
2.2.4 反转录与荧光定量(RT-PCR)
2.2.5 基因敲除质粒的构建
2.2.6 基因回补质粒的构建
2.2.7 农杆菌感受态细胞的制备及转化
2.2.8 指状青霉的遗传转化与转化子筛选
2.2.9 Southern blot分析
2.2.10 对于咪酰胺EC_(50)值测定
2.2.11 生长速率测定
2.2.12 产孢率测定
2.2.13 对于柑橘类水果侵染毒力测定
2.2.14 统计分析
3 结果与分析
3.1 Pdmfs2基因的克隆及序列分析
3.2 Pdmfs2的转录水平分析
3.3 Pdmfs2基因敲除及回补质粒构建
3.4 Pdmfs2突变菌株的筛选与分析
3.5 PdMFS2对于指状青霉咪酰胺抗性及生长速率的作用
3.6 PdMFS2影响指状青霉产孢率及致毒力
4 讨论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
衷心感谢以下基金资助
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]MFS超家族转运蛋白结构基础及转运机制[J]. 邓东,颜宁. 科学通报. 2015(08)
[2]植物病原真菌对甾醇生物合成抑制剂类（SBIs）杀菌剂的抗药性研究进展[J]. 叶滔,马志强,毕秋艳,牛芳胜,韩秀英,张小风,王文桥,张利辉. 农药学学报. 2012(01)
[3]植物内生真菌抗肿瘤药物研究进展(英文)[J]. 邱敏,谢瑞生,史彧,陈海敏. 中国生物工程杂志. 2009(01)
[4]农用杀菌剂作用机理的研究进展[J]. 刁春玲,刘芳,宋宝安. 农药. 2006(06)
[5]植物病原菌抗药性遗传研究[J]. 袁善奎,周明国. 植物病理学报. 2004(04)
[6]丝状真菌对甾醇生物合成抑制剂的抗性分子机制[J]. 李红叶,朱国念,朱金文,谢青云. 菌物系统. 2002(02)
[7]抑制麦角甾醇生物合成的杀菌剂抗性研究[J]. 周明国. 农药. 1987(01)
本文编号：3167623
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3167623.html
