森林草莓锌指蛋白ZFP介导SVBV P6蛋白泛素化的机制研究

发布时间：2021-05-11 06:27

　　病毒致病因子与寄主因子的互作对病毒致病性的影响一直是病毒分子生物学的一个研究热点。SVBV P6蛋白是一个RNA沉默抑制子和症状决定子,与病毒的致病性紧密相关。但迄今为止,尚未见到SVBV P6蛋白与森林草莓蛋白互作的研究报道。本研究以SVBV P6为诱饵蛋白筛选感染SVBV森林草莓的酵母cD NA文库,获得与其互作的寄主因子锌指蛋白ZFP。酵母双杂交、双分子荧光互补（BiF C）和免疫共沉淀（Co-IP）试验方法验证了P6蛋白和ZFP蛋白在体外和体内互作;ZFP蛋白能够影响P6蛋白在植物体内聚集、表达以及减轻P6蛋白介导PVX在本氏烟上的症状表型;蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制ZFP介导P6蛋白的降解。本研究的开展对揭示SVBV P6蛋白与草莓锌指蛋白ZFP互作分子机制以及寄主植物和双链DNA病毒之间防御和反防御机理奠定了理论基础。1 P6蛋白与ZFP蛋白互作验证酵母双杂交验证P6与ZFP互作将pGAD-ZFP+pGBK-P6及pGAD-P6+pG BK-ZFP分别共转化酵母,结果发现,共转化的酵母菌均能够在选择培养基平板上生长,说明P6能够与ZFP互作。BiFC验证P6蛋白与ZF... 

【文章来源】：安徽农业大学安徽省

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

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致谢
中文摘要
Abstract
文献综述
    1 草莓镶脉病毒基本特征及其编码的P6蛋白的功能
        1.1 草莓镶脉病毒基本特征、分布及危害
        1.2 草莓镶脉病毒的分类及基因组编码的蛋白
        1.3 P6蛋白在CaMV各ORF翻译过程中的作用
    2 植物病毒致病因子与寄主因子的互作
    3 植物锌指蛋白的生物学特性及功能
        3.1 锌指蛋白的结构和性质
        3.2 锌指蛋白ZFP对植物生长发育的影响
        3.3 锌指蛋白的抗逆作用
        3.4 锌指蛋白的抗菌作用
        3.5 锌指蛋白的抗病毒作用
        3.6 锌指蛋白能与病毒蛋白互作
    4 泛素/26S蛋白酶体降解系统在植物抗病响应中的作用
        4.1 泛素/26S蛋白酶体降解系统
        4.2 UPS的组成
        4.3 26S蛋白酶体
        4.4 泛素/26S蛋白酶降解系统对植物-病原物互作的响应
引言
材料与方法
    1 供试材料
        1.1 病样来源
        1.2 植物材料
        1.3 菌种载体、质粒
        1.4 酶和化学试剂
        1.5 抗生素使用
        1.6 实验仪器设备
    2 试验方法
        2.1 草莓总DNA提取
        2.2 植物总RNA提取
        2.3 PCR产物纯化、回收和连接载体
            2.3.1 PCR产物连接
        2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.5 连接产物转化大肠杆菌
        2.6 阳性克隆的PCR鉴定
        2.7 质粒提取及质粒鉴定
        2.8 农杆菌瞬时浸润
        2.9 载体构建
        2.10 酵母双杂交实验(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)
            2.10.1 质粒转化酵母(PEG/醋酸锂法)小量制备法,用于单转和双转
            2.10.2 互作验证
        2.11 BIFC实验(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)
        2.12 DAPI染色实验
        2.13 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)
        2.14 qRT-PCR实验
        2.15 载体构建
结果与分析
    1 SVBVP6蛋白与森林草莓锌指蛋白ZFP互作鉴定
        1.1 酵母双杂交(Y2H)验证P6蛋白与ZFP蛋白互作
        1.2 双分子荧光互补验证(BiFC)P6与ZFP在植物体内互作
        1.3 免疫共沉淀实验(Co-IP)验证P6与ZFP在植物体内互作
    2 森林草莓锌指蛋白ZFP基因的序列比较及分子进化分析
        2.1 森林草莓锌指蛋白ZFP核苷酸序列与其他植物锌指蛋白相似性比较
        2.2 森林草莓锌指蛋白ZFP基因系统进化树分析
    3 锌指蛋白ZFP基因在SVBV感染的森林草莓中的差异表达
    4 锌指蛋白ZFP亚细胞定位及其与P6蛋白共定位鉴定
    5 森林草莓锌指蛋白ZFP介导P6在植物体内泛素化降解研究
        5.1 ZFP蛋白能够影响P6蛋白聚集
        5.2 森林草莓ZFP蛋白影响P6蛋白在植物体内表达
        5.3 半体内实验检测26S蛋白酶体抑制剂MG132对P6蛋白降解的抑制作用
        5.4 体内验证蛋白酶体抑制剂能抑制ZFP介导P6蛋白降解
    6 植物ZFP蛋白对P6蛋白介导PVX在本氏烟上症状表型的的影响
讨论
结论
参考文献
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]草莓镶脉病毒研究进展[J]. 肖敏,张志宏.  辽宁农业科学. 2005(04)



本文编号：3180906