罗汉果内生菌中产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选及酶法改性罗汉果苦味苷的研究
发布时间：2021-05-23 03:38
罗汉果在实际的种植中,每年季末因为天气和植物营养消耗的原因,导致很多罗汉果无法成熟,这些未成熟果主要含有苦味的罗汉果苷Ⅱ,这些苷Ⅱ还未转化成高糖苷,形成所谓的苦果。在生产上,这些苦果一般都是被遗弃,造成极大浪费。但罗汉果苦苷和甜苷都是以罗汉果醇为骨架,有着相同的基本骨架,只是C-3和C-24连接的葡萄糖基数量有所差异。在罗汉果甜苷合成的过程中,葡萄糖基转移酶发挥着重要作用,它将葡萄糖基逐个添加到苦味苷上,使苦味的低糖苷转化为甜味的高糖苷。而罗汉果内生菌长期与罗汉果互利共生,可能会与罗汉果发生基因交流,有可能从罗汉果内生菌中筛选出产生糖基转移酶的菌株。因此,研究从罗汉果内生菌中筛选出产环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的菌株,并对菌株进行鉴定,再优化该菌株的产酶条件,建立以硫酸铵盐析、透析和葡聚糖凝胶柱层析为主的分离纯化体系,从而得到CGTase,并测定该酶的酶学性质,最后初步探讨CGTase对罗汉果苦味苷的转化作用。主要完成的内容如下:1.罗汉果内生菌的分离选用75%乙醇和3%次氯酸钠对罗汉果根、茎和果实消毒,不断增加或减少消毒时间,根据消毒效果,对不同部位选择不同消毒时间。再将消毒...
【文章来源】：广西师范大学广西壮族自治区
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 天然甜味剂的研究现状
1.2 罗汉果苷类及苷类转化研究
1.2.1 罗汉果苷类
1.2.2 罗汉果苷类代谢
1.2.3 罗汉果苦味果的形成
1.3 植物内生菌及研究进展
1.3.1 植物内生菌的多样性
1.3.2 植物内生菌活性成分的多样性
1.3.3 内生菌与宿主植物间的相互影响
1.4 CGTase在生物转化中应用
1.4.1 CGTase的来源
1.4.2 CGTase酶的功能
1.4.3 CGTase酶法改性研究
1.5 本研究的目的意义和主要内容
1.5.1 目的意义
1.5.2 主要研究内容
第二章 罗汉果根、茎、果内生菌的分离纯化
2.1 材料与设备
2.1.1 实验材料与试剂
2.1.2 实验仪器
2.1.3 培养基
2.2 实验方法
2.2.1 采样及预处理
2.2.2 根、茎、果表面消毒时间的优化
2.2.3 对照实验的设置
2.2.4 罗汉果内生菌的纯化
2.2.5 内生菌的分类及保藏
2.3 结果与分析
2.3.1 材料消毒时间的确定
2.3.2 表面消毒检测
2.3.3 罗汉果各部位内生菌分离纯化结果
2.4 本章小结
第三章 罗汉果内生菌中产CGTase菌株的筛选及鉴定
3.1 材料与仪器
3.1.1 实验材料与试剂
3.1.2 实验仪器
3.1.3 溶液的配制
3.1.4 培养基的配制
3.2 实验方法
3.2.1 菌株发酵培养
3.2.2 CGTase产生菌的初筛
3.2.3 CGTase产生菌的的复筛
3.2.4 CGTase酶活的测定
3.2.5 CGTase产生菌的形态鉴定
3.2.6 CGTase产生菌的分子生物学鉴定
3.3 结果与分析
3.3.1 产葡萄糖基转移酶菌株的快速筛选结果
3.3.2 ND-6的形态鉴定
3.3.3 菌株ND-6的16SrDNA扩增结果
3.3.4 菌株ND-6的16SrDNA测序结果
3.3.5 菌株ND-6系统发育树的构建
3.4 本章小结
第四章 菌株ND-6产酶条件优化
4.1 材料与仪器
4.1.1 实验材料与试剂
4.1.2 实验仪器
4.1.3 培养基
4.2 实验方法
4.2.1 发酵及发酵的预处理
4.2.2 酶活的测定
4.2.3 单因素试验
4.2.4 菌株ND-6发酵条件正交试验优化
4.3 结果与分析
4.3.1 碳源种类及添加量的选择
4.3.2 氮源种类及添加量的选择
4.3.3 培养温度对菌株产酶的影响
4.3.4 初始pH值对菌株产酶的影响
4.3.5 装液量对菌株产酶的影响
4.3.6 正交实验优化ND-6的发酵条件
4.3.7 验证试验
4.4 本章小结
第五章 CGTase的分离纯化及酶学性质研究
5.1 材料与试剂
5.1.1 实验材料与试剂
5.1.2 实验仪器
5.1.3 培养基
5.1.4 溶液的配制
5.2 实验方法
5.2.1 粗酶的制备
5.2.2 酶活的测定
5.2.3 硫酸铵盐析
5.2.4 透析
5.2.5 SephadexG-200凝胶过滤层析
5.2.6 蛋白质的测定
5.2.7 环糊精葡萄糖基转移酶的纯度及相对分子量测定
5.2.8 酶学性质测定
5.3 结果与分析
5.3.1 硫酸铵盐析
5.3.2 凝胶过滤层析
5.3.3 酶的纯化结果
5.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳测定CGTaase纯度及分子量
5.3.5 pH值对酶活的影响
5.3.6 pH值对酶稳定性的影响
5.3.7 温度对酶活的影响
5.3.8 温度对酶热稳定性的影响
5.3.9 金属离子对酶活的影响
5.4 本章小结
第六章 罗汉果苦味皂苷的制备及酶法改性苦味苷的研究
6.1 材料与试剂
6.1.1 实验材料和试剂
6.1.2 实验仪器
6.2 实验方法
6.2.1 罗汉果苦味苷的提取工艺
6.2.2 罗汉果苦味苷的AB-8大孔树脂纯化
6.2.3 罗汉果苦味苷的D330离子交换树脂纯化
6.2.4 罗汉果苦味苷的硅胶柱层析纯化
6.2.5 CGTase对罗汉果苦味苷的转化方法
6.2.6 TLC检测
6.2.7 高效液相色谱检测
6.2.8 感官评价
6.3 结果与分析
6.3.1 大孔吸附树脂分离结果
6.3.2 硅胶柱分离纯化结果
6.3.3 TLC检测结果
6.3.4 口味评定
6.3.5 HPLC测定
6.4 本章小结
第七章 总结与展望
7.1 总结
7.2 问题与展望
参考文献
攻读硕士期间发表论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]人参内生菌B69菌株抑菌活性物质产生条件的优化[J]. 林星辰,王泽,牛林飞,田义新. 人参研究. 2018(01)
[2]罗汉果内生真菌的分离及其发酵产物的抗氧化活性研究[J]. 范彩琴,张昌志,龙楚媚,付强,赵丰丽,宋云飞,杨文国. 中国酿造. 2017(12)
[3]糖基化改性甜菊苷、橙皮苷及芦丁苷作为新型药物载体的研究与应用[J]. 汪胡芳,莫丽英,王杏利,赵笛,吴春勇,林以宁,张峻颖. 中国实验方剂学杂志. 2017(23)
[4]茄子青枯病拮抗放线菌XL-6的筛选、鉴定及发酵条件优化[J]. 李威,肖熙鸥,李可,高晓敏,吕玲玲. 微生物学通报. 2018(02)
[5]罗汉果内生菌及其周边土壤中产α-淀粉酶菌株的筛选[J]. 赵丰丽,吴奔,张昌志,范彩琴,宋云飞,杨文国,陈静. 食品科学技术学报. 2017(03)
[6]SDS-PAGE凝胶电泳法对不同种鹿茸蛋白质差异化研究[J]. 朱云飞,初正云,李洪江. 辽宁中医药大学学报. 2017(06)
[7]罗汉果鲜果皂甙分析方法的建立及其在采后贮藏中的变化[J]. 陈秋平,朱慧玲,刘合生,喻柯柯,戚向阳,宋云飞. 核农学报. 2017(01)
[8]α-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株YLW-8的鉴定[J]. 邓媛,李皎,杨国武,毛勇,汪大敏. 陕西农业科学. 2015(12)
[9]罗汉果醇抗肿瘤活性及其作用机制研究[J]. 符毓夏,王磊,李典鹏. 广西植物. 2016(11)
[10]功能性甜味剂罗汉果甜苷的生理功能及食品应用研究进展[J]. 万艳娟,吴军林,吴清平. 食品与发酵科技. 2015(05)
博士论文
[1]β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的分泌表达及其热稳定性研究[D]. 李才明.江南大学 2014
[2]高纯度莱鲍迪苷A的制备和甜菊苷的酶法改性研究[D]. 叶发银.江南大学 2013
[3]甜菊苷的酶促糖基化和水解反应研究[D]. 万会达.江南大学 2012
[4]知母皂苷BII的生物转化及其糖基化酶的研究[D]. 周文斌.中国人民解放军军事医学科学院 2010
硕士论文
[1]罗汉果干燥技术及其皂苷类成分提取分离的研究[D]. 刘曜儒.仲恺农业工程学院 2016
[2]产甜甙V罗汉果内生真菌的研究[D]. 蒋智.广西师范大学 2015
[3]罗汉果块根内生真菌及其次级代谢产物的研究[D]. 付东兴.广西大学 2013
[4]高纯罗汉果苷V的提取纯化技术研究[D]. 李倩.湖南农业大学 2011
[5]人参根际土壤真菌与内生真菌的多样性及人参皂苷生物催化活性菌株的筛选[D]. 张薇.辽宁师范大学 2011
[6]罗汉果总苷的微生物转化研究[D]. 司鹏鹏.上海师范大学 2011
[7]天然甜味剂罗汉果皂甙的制备、分析及特性研究[D]. 张云竹.华中农业大学 2005
[8]产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株分离、产酶条件优化与酶学特性研究[D]. 陈龙然.浙江大学 2005
本文编号：3202213
【文章来源】：广西师范大学广西壮族自治区
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 天然甜味剂的研究现状
1.2 罗汉果苷类及苷类转化研究
1.2.1 罗汉果苷类
1.2.2 罗汉果苷类代谢
1.2.3 罗汉果苦味果的形成
1.3 植物内生菌及研究进展
1.3.1 植物内生菌的多样性
1.3.2 植物内生菌活性成分的多样性
1.3.3 内生菌与宿主植物间的相互影响
1.4 CGTase在生物转化中应用
1.4.1 CGTase的来源
1.4.2 CGTase酶的功能
1.4.3 CGTase酶法改性研究
1.5 本研究的目的意义和主要内容
1.5.1 目的意义
1.5.2 主要研究内容
第二章 罗汉果根、茎、果内生菌的分离纯化
2.1 材料与设备
2.1.1 实验材料与试剂
2.1.2 实验仪器
2.1.3 培养基
2.2 实验方法
2.2.1 采样及预处理
2.2.2 根、茎、果表面消毒时间的优化
2.2.3 对照实验的设置
2.2.4 罗汉果内生菌的纯化
2.2.5 内生菌的分类及保藏
2.3 结果与分析
2.3.1 材料消毒时间的确定
2.3.2 表面消毒检测
2.3.3 罗汉果各部位内生菌分离纯化结果
2.4 本章小结
第三章 罗汉果内生菌中产CGTase菌株的筛选及鉴定
3.1 材料与仪器
3.1.1 实验材料与试剂
3.1.2 实验仪器
3.1.3 溶液的配制
3.1.4 培养基的配制
3.2 实验方法
3.2.1 菌株发酵培养
3.2.2 CGTase产生菌的初筛
3.2.3 CGTase产生菌的的复筛
3.2.4 CGTase酶活的测定
3.2.5 CGTase产生菌的形态鉴定
3.2.6 CGTase产生菌的分子生物学鉴定
3.3 结果与分析
3.3.1 产葡萄糖基转移酶菌株的快速筛选结果
3.3.2 ND-6的形态鉴定
3.3.3 菌株ND-6的16SrDNA扩增结果
3.3.4 菌株ND-6的16SrDNA测序结果
3.3.5 菌株ND-6系统发育树的构建
3.4 本章小结
第四章 菌株ND-6产酶条件优化
4.1 材料与仪器
4.1.1 实验材料与试剂
4.1.2 实验仪器
4.1.3 培养基
4.2 实验方法
4.2.1 发酵及发酵的预处理
4.2.2 酶活的测定
4.2.3 单因素试验
4.2.4 菌株ND-6发酵条件正交试验优化
4.3 结果与分析
4.3.1 碳源种类及添加量的选择
4.3.2 氮源种类及添加量的选择
4.3.3 培养温度对菌株产酶的影响
4.3.4 初始pH值对菌株产酶的影响
4.3.5 装液量对菌株产酶的影响
4.3.6 正交实验优化ND-6的发酵条件
4.3.7 验证试验
4.4 本章小结
第五章 CGTase的分离纯化及酶学性质研究
5.1 材料与试剂
5.1.1 实验材料与试剂
5.1.2 实验仪器
5.1.3 培养基
5.1.4 溶液的配制
5.2 实验方法
5.2.1 粗酶的制备
5.2.2 酶活的测定
5.2.3 硫酸铵盐析
5.2.4 透析
5.2.5 SephadexG-200凝胶过滤层析
5.2.6 蛋白质的测定
5.2.7 环糊精葡萄糖基转移酶的纯度及相对分子量测定
5.2.8 酶学性质测定
5.3 结果与分析
5.3.1 硫酸铵盐析
5.3.2 凝胶过滤层析
5.3.3 酶的纯化结果
5.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳测定CGTaase纯度及分子量
5.3.5 pH值对酶活的影响
5.3.6 pH值对酶稳定性的影响
5.3.7 温度对酶活的影响
5.3.8 温度对酶热稳定性的影响
5.3.9 金属离子对酶活的影响
5.4 本章小结
第六章 罗汉果苦味皂苷的制备及酶法改性苦味苷的研究
6.1 材料与试剂
6.1.1 实验材料和试剂
6.1.2 实验仪器
6.2 实验方法
6.2.1 罗汉果苦味苷的提取工艺
6.2.2 罗汉果苦味苷的AB-8大孔树脂纯化
6.2.3 罗汉果苦味苷的D330离子交换树脂纯化
6.2.4 罗汉果苦味苷的硅胶柱层析纯化
6.2.5 CGTase对罗汉果苦味苷的转化方法
6.2.6 TLC检测
6.2.7 高效液相色谱检测
6.2.8 感官评价
6.3 结果与分析
6.3.1 大孔吸附树脂分离结果
6.3.2 硅胶柱分离纯化结果
6.3.3 TLC检测结果
6.3.4 口味评定
6.3.5 HPLC测定
6.4 本章小结
第七章 总结与展望
7.1 总结
7.2 问题与展望
参考文献
攻读硕士期间发表论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]人参内生菌B69菌株抑菌活性物质产生条件的优化[J]. 林星辰,王泽,牛林飞,田义新. 人参研究. 2018(01)
[2]罗汉果内生真菌的分离及其发酵产物的抗氧化活性研究[J]. 范彩琴,张昌志,龙楚媚,付强,赵丰丽,宋云飞,杨文国. 中国酿造. 2017(12)
[3]糖基化改性甜菊苷、橙皮苷及芦丁苷作为新型药物载体的研究与应用[J]. 汪胡芳,莫丽英,王杏利,赵笛,吴春勇,林以宁,张峻颖. 中国实验方剂学杂志. 2017(23)
[4]茄子青枯病拮抗放线菌XL-6的筛选、鉴定及发酵条件优化[J]. 李威,肖熙鸥,李可,高晓敏,吕玲玲. 微生物学通报. 2018(02)
[5]罗汉果内生菌及其周边土壤中产α-淀粉酶菌株的筛选[J]. 赵丰丽,吴奔,张昌志,范彩琴,宋云飞,杨文国,陈静. 食品科学技术学报. 2017(03)
[6]SDS-PAGE凝胶电泳法对不同种鹿茸蛋白质差异化研究[J]. 朱云飞,初正云,李洪江. 辽宁中医药大学学报. 2017(06)
[7]罗汉果鲜果皂甙分析方法的建立及其在采后贮藏中的变化[J]. 陈秋平,朱慧玲,刘合生,喻柯柯,戚向阳,宋云飞. 核农学报. 2017(01)
[8]α-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株YLW-8的鉴定[J]. 邓媛,李皎,杨国武,毛勇,汪大敏. 陕西农业科学. 2015(12)
[9]罗汉果醇抗肿瘤活性及其作用机制研究[J]. 符毓夏,王磊,李典鹏. 广西植物. 2016(11)
[10]功能性甜味剂罗汉果甜苷的生理功能及食品应用研究进展[J]. 万艳娟,吴军林,吴清平. 食品与发酵科技. 2015(05)
博士论文
[1]β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的分泌表达及其热稳定性研究[D]. 李才明.江南大学 2014
[2]高纯度莱鲍迪苷A的制备和甜菊苷的酶法改性研究[D]. 叶发银.江南大学 2013
[3]甜菊苷的酶促糖基化和水解反应研究[D]. 万会达.江南大学 2012
[4]知母皂苷BII的生物转化及其糖基化酶的研究[D]. 周文斌.中国人民解放军军事医学科学院 2010
硕士论文
[1]罗汉果干燥技术及其皂苷类成分提取分离的研究[D]. 刘曜儒.仲恺农业工程学院 2016
[2]产甜甙V罗汉果内生真菌的研究[D]. 蒋智.广西师范大学 2015
[3]罗汉果块根内生真菌及其次级代谢产物的研究[D]. 付东兴.广西大学 2013
[4]高纯罗汉果苷V的提取纯化技术研究[D]. 李倩.湖南农业大学 2011
[5]人参根际土壤真菌与内生真菌的多样性及人参皂苷生物催化活性菌株的筛选[D]. 张薇.辽宁师范大学 2011
[6]罗汉果总苷的微生物转化研究[D]. 司鹏鹏.上海师范大学 2011
[7]天然甜味剂罗汉果皂甙的制备、分析及特性研究[D]. 张云竹.华中农业大学 2005
[8]产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株分离、产酶条件优化与酶学特性研究[D]. 陈龙然.浙江大学 2005
本文编号：3202213
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