大葱细胞质雄性不育候选基因的克隆与差异表达分析

发布时间：2021-07-05 21:35

　　发掘并克隆大葱细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility, CMS）目关基因,是阐明其CMS分子机理的关键。本研究以鞭杆葱不育系和保持系为材料,采用同源克隆与环化RNA反转录聚合酶链式反应（CR-RT-PCR）技术方法相结合克隆大葱线粒体基因atp6, atpA, nad9, nad5, orfl 92, orflll, orfl 00, mat-R全长；通过序列对比,找出鞭杆葱雄性线粒体基因不育系与保持系之间的差异；同时对这些候选基因进行差异表达分析。对以上结果进行综合分析,最终确认雄性不育候选基因,以便进行深入研究。主要结果如下：1、CR-RT-PCR技术的优化以鞭杆葱花蕾为材料,通过改变RNA反应时间和试剂添加对环化RNA反转录聚合酶链式反应（CR-RT-PCR）技术进行了优化,并用优化后的技术克隆大葱线粒体cob基因的全长。结果表明最优环化反应条件为：RNA首先65℃反应5min，加入反应试剂后15℃反应2 h,最后70℃反应10min使酶失活,反应体系中不必添加催化剂PEG6000。实验结果表明,cob基因全长为1522bp,无poly （A）尾,包... 

【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 雄性不育的概述
        1.1.1 植物雄性不育的概念
        1.1.2 植物雄性不育的分类
    1.2 大葱雄性不育的来源
        1.2.1 通过自然变异获取大葱雄性不育系
        1.2.2 通过种间杂交获得大葱雄性不育系
        1.2.3 通过基因工程获得大葱雄性不育系
    1.3 大葱雄性不育机理的研究
        1.3.1 大葱细胞质雄性不育在形态水平的表现
        1.3.2 大葱细胞质雄性不育细胞形态学研究
        1.3.3 大葱雄性不育的分子机理研究
    1.4 植物细胞质雄性不育相关基因的研究开发
    1.5 植物雄性不育在生产中的应用
    1.6 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 植株材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
    2.2 内容与方法
        2.2.1 大葱总RNA的提取
        2.2.2 RNA环化
        2.2.3 RNA反转录及PCR扩增
        2.2.4 目的片段的回收
        2.2.5 目的片段的克隆
        2.2.6 目的基因全长的拼接及全长的克隆
        2.2.7 系统发育树分析
        2.2.8 制备荧光荧光定量双标曲线cDNA模板
3 结果与分析
    3.1 CR-RT-PCR技术结果与分析
        3.1.1 RNA检测
        3.1.2 CR-RT-PCR反应中RNA环化反应条件的优化
        3.1.3 cob内部基因的扩增
        3.1.4 cob序列测定与氨基酸结构分析
        3.1.5 系统发育分析
    3.2 雄性不育候选基因克隆结果与分析
        3.2.1 atp6基因全长的克隆与生物信息学分析
        3.2.2 atpA基因全长的克隆与生物信息学分析
        3.2.3 nad9基因全长的克隆与生物信息学分析
        3.2.4 nad5基因全长的克隆与生物信息学分析
        3.2.5 orf192基因全长的克隆与生物信息学分析
        3.2.6 orf111基因全长的克隆与生物信息学分析
        3.2.7 orf100基因全长的克隆与生物信息学分析
        3.2.8 mat-R基因全长的克隆与生物信息学分析
    3.3 雄性不育候选基因的qRT-PCR表达分析
4 讨论
    4.1 CR-RT-PCR技术的探究
    4.2 线粒体能量代谢基因atp6与大葱CMS的关系
    4.3 线粒体能量代谢基因atpA与大葱CMS的关系
    4.4 NADH脱氢酶复合体基因与大葱CMS关系
    4.5 orfs基因与大葱CMS关系
    4.6 mat-R基因与CMS关系
5 全文总结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]葱属作物遗传多样性研究进展[J]. 吴凤芝,金雪.  东北农业大学学报. 2014(01)
[2]植物细胞核雄性不育基因研究进展[J]. 杨莉芳,刁现民.  植物遗传资源学报. 2013(06)
[3]洋葱异源胞质雄性不育候选基因atp6的克隆与表达分析[J]. 周晓娟,赵瑞,王永勤.  沈阳农业大学学报. 2012(02)
[4]甘蓝胞质雄性不育系CMS158小孢子发生的细胞学研究[J]. 许忠民,张恩慧,程永安,巩振辉,马青山.  西北农业学报. 2012(03)
[5]一种高效获取基因5′末端的RACE方法[J]. 罗聪,何新华,陈虎,韦泳丽,李明娟.  植物生理学报. 2011(04)
[6]大白菜核雄性不育相关基因BrLTP1的克隆及特征分析[J]. 刘志勇,叶雪凌,李承彧,冯辉.  园艺学报. 2011(02)
[7]Application of Molecular Markers Linking to Cytoplasmic Male Sterile Loci to Assist Maintainer Line Selection and Their Selection Efficiency in Welsh Onion （Allium fistulosum L.）[J]. GAI Shu-peng1 and MENG Xiang-dong2 1 College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, P.R.China 2 College of Horticulture, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, P.R.China.  Agricultural Sciences in China. 2010(11)
[8]两个洋葱雄性不育系细胞质类型的鉴定与分析[J]. 吴海涛,王建军,侯喜林,刘洪炯,马蓉莉,马景蕃.  园艺学报. 2009(05)
[9]洋葱细胞质雄性不育系选育研究进展[J]. 吴海涛,马蓉丽,刘洪炯,焦彦生.  园艺学报. 2009(02)
[10]异常线粒体基因ORF25可能导致烟草雄性不育[J]. 刘齐元,朱滕义,赵婷,黄海泉.  江西农业大学学报. 2009(01)

博士论文
[1]芥菜型油菜胞质不育Hau CMS不育相关基因的鉴定及其功能分析[D]. 景兵.华中农业大学 2012

硕士论文
[1]棉花细胞质雄性不育相关线粒体基因筛选[D]. 巩养仓.中国农业科学院 2008
[2]主要作物EST分析系统的构建及应用[D]. 汤继凤.中国农业科学院 2004



本文编号：3266867