盐胁迫下南瓜ERF基因的鉴定及CmHKT1互作蛋白的筛选
发布时间：2021-07-17 11:48
南瓜根系发达、抗逆性强,常被用作西瓜及其他葫芦科作物的砧木。课题组前期研究发现,采用耐盐南瓜砧木嫁接黄瓜可以有效限制Na+向地上部运输,提高黄瓜的耐盐能力。Cm HKT1是Na+转运蛋白,主要功能是卸载木质部的Na+,关于Cm HKT1参与盐胁迫响应的分子调控机制仍然未知。ERF是植物特有的转录因子家族之一,能够参与多种植物逆境调控。截至目前,在多个植物体全基因组中鉴定了ERF家族成员,而南瓜中未有报道。因此,本论文研究工作从南瓜ERF基因家族鉴定和盐胁迫下表达谱分析、南瓜Cm HKT1互作蛋白的筛选及功能验证两个方面开展,所取得的结果如下:1. 利用生物信息学方法在南瓜全基因组中共鉴定到131个ERF家族成员。根据系统进化树聚类关系,将南瓜ERF成员分为12个小组。南瓜ERF家族成员均含有3个β折叠、1个α螺旋,同一个ERF小组内motif数量、种类以及排列顺序具有一致性,进一步说明分组的可靠性。2. 南瓜131个ERF成员中大约17%来源于散点复制,81%来源于染色体片段复制。伴随着南瓜最近一次（30 MYA,Ks～...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
盐胁迫下植物排Na+机制（Almeidaetal2017）
盐胁迫下南瓜ERF基因的鉴定及CmHKT1互作蛋白的筛选5CY162[MATa,Δtrk1,trk2::pCK64，his3,leu2,ura3,trp1,ade2]trk1和trk2的功能。同时，将其转入盐敏感酵母菌株G19（Δena1-4），发现其Na+转运特性缺失。结合上面的研究发现，可以依据PA-Loop的保守位点是Ser或Gly来判断HKT离子吸收转运特性，因此可以分为Ⅰ类（钠离子转运特性）和Ⅱ类（Na+-K+协同转运特性）HKT蛋白(Mseretal2002)。但还有一些研究发现，仅仅依据PA-Loop区域的保守位点不一定能准确的判断某个HKT成员属于Ⅰ类还是Ⅱ类，盐芥中有两个HKT家族成员，分别是EpHKT1;1和EpHKT1;2，酵母表达实验发现EpHKT1;1对Na+高亲和性，而EpHKT1;2则对K+高亲和性，经序列比对，两个HKT蛋白序列中PB-Loop区域的一个位点存在着差异，分别对应Asn213和Asp205，而把EpHKT1;2的Asp205突变成Asn，那么EpHKT1;2则表现为Na+亲和性，表明PB-Loop区域的Asp/Asn位点能够决定Ⅰ类HKT蛋白的离子转运特性(Alietal2018)。因此得出结论，仅通过PA-LoopSer/Gly位点来判定HKT的离子转运类型是不够充分的。本课题组的孙静宇将含有空载质粒和CmHKT1重组质粒分别转入盐敏感酵母菌株G19，在100mMNaCl的培养基上进行培养，结果发现含有CmHKT1的G19酵母的生长受到明显抑制。另一方面，CmHKT1不能互补K+吸收缺陷酵母WΔ6trk1和trk2的功能。结合两部分实验结果得出结论，南瓜CmHKT1属于Ⅰ类HKT成员且具有Na+转运特性（孙静宇2019）。图1-2植物HKT蛋白的结构及分类（Hamamotoetal2015)Fig.1-2StructureandclassificationofplantHKTprotein
盐胁迫下南瓜ERF基因的鉴定及CmHKT1互作蛋白的筛选71.2.2.4膜蛋白酵母双杂交系统酵母双杂交广泛用于细胞核内互作蛋白的筛选工作，然而对于膜蛋白来说，这种方法存在局限性。瑞士DualsystemsBiotechAG公司推出了一种基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统，能够很方便地用于膜蛋白相互作用的检测（Stagljaretal1998）。原理如图1-3所示。泛素是一个分子量小且高度保守的蛋白，能够与赖氨酸残基结合对其他蛋白进行标记，被标记的蛋白被26S蛋白酶降解(PickartandEddins2004)。Johnsson等人发现泛素能够人为的分成两个部分：N端（Nub）、C端（Cub）(JohnssonandVarshavsky1994)。正常情况下，Nub和Cub仍具有很高的亲和力，仍发挥降解蛋白质的信号功能，因此将Nub的第三位异亮氨酸变成甘氨酸形成NubG，这样与Cub的亲和能力大大降低，避免了Cub与Nub自我结合或接近的可能性。将Cub部分与人工合成的LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下NubG不与Cub结合，泛素特异蛋白酶UBPs不能识别分离的泛素，转录激活因子不会被切下来。因此，利用这一设计原理，可以将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成bait融合蛋白（bait-cub-LexA-VP16）和prey融合蛋白（prey-NubG）。一旦bait和prey发生相互作用，就会使得NubG和Cub的相互接近，重新组合成泛素，UBPs识别重组泛素后导致LexA-VP16转录因子的解离，于是LexA-VP16进入细胞核激活报告基因的转录，通过对报告基因的检测结果判断蛋白蛋白之间的相互作用（StagljarandFields2002）。图1-3分离泛素介导的膜蛋白酵母双杂交原理（Thaminyetal2003）Fig.1-3Theprincipleofseparatingubiquitin-mediatedmembraneproteinyeasttwo-hybrid
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物AP2/ERF转录因子及其在非生物胁迫应答中的作用[J]. 高春艳,吴芮,袁玉,刘同玥,任莉萍. 江汉大学学报(自然科学版). 2017(03)
[2]COPII各组分在蛋白质分泌途径中的功能[J]. 徐晓峰,普雪娇,莫蓓莘. 生命科学. 2016(04)
[3]南瓜植物的起源和分类[J]. 林德佩. 中国西瓜甜瓜. 2000(01)
博士论文
[1]南瓜CmHKT1;1提高黄瓜嫁接苗耐盐性的机理及相关microRNAs鉴定[D]. 孙静宇.华中农业大学 2019
硕士论文
[1]籽用南瓜种质资源遗传多样性研究[D]. 刘超.东北农业大学 2012
本文编号：3288119
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
盐胁迫下植物排Na+机制（Almeidaetal2017）
盐胁迫下南瓜ERF基因的鉴定及CmHKT1互作蛋白的筛选5CY162[MATa,Δtrk1,trk2::pCK64，his3,leu2,ura3,trp1,ade2]trk1和trk2的功能。同时，将其转入盐敏感酵母菌株G19（Δena1-4），发现其Na+转运特性缺失。结合上面的研究发现，可以依据PA-Loop的保守位点是Ser或Gly来判断HKT离子吸收转运特性，因此可以分为Ⅰ类（钠离子转运特性）和Ⅱ类（Na+-K+协同转运特性）HKT蛋白(Mseretal2002)。但还有一些研究发现，仅仅依据PA-Loop区域的保守位点不一定能准确的判断某个HKT成员属于Ⅰ类还是Ⅱ类，盐芥中有两个HKT家族成员，分别是EpHKT1;1和EpHKT1;2，酵母表达实验发现EpHKT1;1对Na+高亲和性，而EpHKT1;2则对K+高亲和性，经序列比对，两个HKT蛋白序列中PB-Loop区域的一个位点存在着差异，分别对应Asn213和Asp205，而把EpHKT1;2的Asp205突变成Asn，那么EpHKT1;2则表现为Na+亲和性，表明PB-Loop区域的Asp/Asn位点能够决定Ⅰ类HKT蛋白的离子转运特性(Alietal2018)。因此得出结论，仅通过PA-LoopSer/Gly位点来判定HKT的离子转运类型是不够充分的。本课题组的孙静宇将含有空载质粒和CmHKT1重组质粒分别转入盐敏感酵母菌株G19，在100mMNaCl的培养基上进行培养，结果发现含有CmHKT1的G19酵母的生长受到明显抑制。另一方面，CmHKT1不能互补K+吸收缺陷酵母WΔ6trk1和trk2的功能。结合两部分实验结果得出结论，南瓜CmHKT1属于Ⅰ类HKT成员且具有Na+转运特性（孙静宇2019）。图1-2植物HKT蛋白的结构及分类（Hamamotoetal2015)Fig.1-2StructureandclassificationofplantHKTprotein
盐胁迫下南瓜ERF基因的鉴定及CmHKT1互作蛋白的筛选71.2.2.4膜蛋白酵母双杂交系统酵母双杂交广泛用于细胞核内互作蛋白的筛选工作，然而对于膜蛋白来说，这种方法存在局限性。瑞士DualsystemsBiotechAG公司推出了一种基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统，能够很方便地用于膜蛋白相互作用的检测（Stagljaretal1998）。原理如图1-3所示。泛素是一个分子量小且高度保守的蛋白，能够与赖氨酸残基结合对其他蛋白进行标记，被标记的蛋白被26S蛋白酶降解(PickartandEddins2004)。Johnsson等人发现泛素能够人为的分成两个部分：N端（Nub）、C端（Cub）(JohnssonandVarshavsky1994)。正常情况下，Nub和Cub仍具有很高的亲和力，仍发挥降解蛋白质的信号功能，因此将Nub的第三位异亮氨酸变成甘氨酸形成NubG，这样与Cub的亲和能力大大降低，避免了Cub与Nub自我结合或接近的可能性。将Cub部分与人工合成的LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下NubG不与Cub结合，泛素特异蛋白酶UBPs不能识别分离的泛素，转录激活因子不会被切下来。因此，利用这一设计原理，可以将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成bait融合蛋白（bait-cub-LexA-VP16）和prey融合蛋白（prey-NubG）。一旦bait和prey发生相互作用，就会使得NubG和Cub的相互接近，重新组合成泛素，UBPs识别重组泛素后导致LexA-VP16转录因子的解离，于是LexA-VP16进入细胞核激活报告基因的转录，通过对报告基因的检测结果判断蛋白蛋白之间的相互作用（StagljarandFields2002）。图1-3分离泛素介导的膜蛋白酵母双杂交原理（Thaminyetal2003）Fig.1-3Theprincipleofseparatingubiquitin-mediatedmembraneproteinyeasttwo-hybrid
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物AP2/ERF转录因子及其在非生物胁迫应答中的作用[J]. 高春艳,吴芮,袁玉,刘同玥,任莉萍. 江汉大学学报(自然科学版). 2017(03)
[2]COPII各组分在蛋白质分泌途径中的功能[J]. 徐晓峰,普雪娇,莫蓓莘. 生命科学. 2016(04)
[3]南瓜植物的起源和分类[J]. 林德佩. 中国西瓜甜瓜. 2000(01)
博士论文
[1]南瓜CmHKT1;1提高黄瓜嫁接苗耐盐性的机理及相关microRNAs鉴定[D]. 孙静宇.华中农业大学 2019
硕士论文
[1]籽用南瓜种质资源遗传多样性研究[D]. 刘超.东北农业大学 2012
本文编号：3288119
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