黄瓜响应低氮胁迫基因CsAOC3的克隆和功能分析
发布时间：2021-07-20 07:40
黄瓜（Cucumis sativus L.）是我国重要的园艺作物之一。黄瓜也是一种典型的喜氮作物,氮素缺乏会严重影响植株的生长,最终影响黄瓜的产量及品质。为了追求更高的产量,黄瓜生产上会出现过量施用氮肥的现象,过量施用氮肥时作物对氮的利用率低,并且残留的氮肥会破坏农业及生态环境,科学施用氮肥的同时挖掘黄瓜响应低氮基因、培育响应低氮黄瓜品种是解决上述问题的有效途径。本研究以黄瓜D0328为试验材料,结合前期试验结果,利用RT-PCR同源序列克隆技术,克隆黄瓜响应氮素胁迫相关基因CsAOC3,利用qRT-PCR技术对CsAOC3表达情况进行了检测,并进一步通过转基因技术对其功能进行了分析。主要研究结果如下:（1）结合实验室前期表达谱数据结果,筛选获得了一个可能参与黄瓜响应氮素胁迫的基因CsAOC3,以黄瓜叶片cDNA为模板,利用黄瓜基因组网站基因序列信息设计引物,经PCR扩增出1条约750 bp的亮带,测序结果表明其基因全长为753 bp,蛋白编码251个氨基酸,蛋白质的分子量为27.17kD,不稳定系数为51.92,理论等电点为8.93,平均亲水系数为-0.155。蛋白同源比对结果表明C...
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－３?蛋Ｈ保守结构域分析??
?１??０２??图３－４?ＣｓＡＯＣ３蛋Ｈ与其他植物ＡＯＣ蛋闩系统进化树分析??Ｆｉｇ．３－４?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＣｓＡＯＣ３?ｐｒｏｔｅｉｎ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?ｐｌａｎｔ?ＡＯＣ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??３．４?Ｃ＾４０Ｃ３在低氮胁迫条件下的表达分析??在播种３７?ｄ后对低氮处理和正常氮处理的两个黄瓜品系Ｄ０３２８和Ｄ０４２２第３片叶进行??取材，提取总ＲＮＡ，通过反转朵获得ｃＤＮＡ〇利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术对Ｄ０３２８和Ｄ０４２２两个响??应低氮能力不同的黄瓜品系在低氮和正常氮情况下表达情况进行了分析（图５）。??结果表明，和正常氮处理相比，响应低氮胁迫的黄瓜Ｄ０３２８在低氮胁迫条件件下ＣＭＯＣＪ的??表达景显著上调，增加了?１１倍之多；而对于响应低氮胁迫弱的黄瓜Ｄ０４２２，在低氮胁迫处理??和正常氮处理时Ｃ＾ＩＯＣＪ的表达量并没有明显变化（图５）。??１６
３．５．３质粒双酶切验证??对经过纯化回收的目的片段再用限制性内切酶；Ｉ和Ｉ对其进行双酶切鉴定。??ＰＣＲ结果显示如图３－８，泳道２、３为ＰＣＲ扩增出的耐低氮基因Ｃ＾ＯＣ？片段，进一步证明??Ｃ＾４（？Ｃ５基因已经成功转入表达载体。??．￥■?＇＾―ｉ??Ｍ：２ＫＭａｋｅｎ?２、３目的基因条带：丨、４：阴性对照??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?２Ｋ；?２，?３：?ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ?ｂａｎｄ；?１，４：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｐｌａｎｔ；??图３－８重组质粒双酶切验证??Ｆｉｇ?３－８?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｗａｓ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．５．４重组质粒导入根癌农杆菌??农杆菌是常用的植物遗传转化体系，又被称为“自然界最小的遗传工程师”，农杆菌介??疔法具有简便、高效、低拷Ｗ数等特点【７３］。本研究也试图通过农杆菌将ＲＮＡ干涉片段疔入??拟南芥中。因此，将ＰＢＩ１２１－Ｃ＾ＯＣＪ表达载体转入农奸菌是构建ＲＮＡ表达载体的关键一步。??本实验采用冷溶法制备感受态细胞，对已导入超表达载体质粒的农杆菌提取质粒ＤＮＡ，进行??ＰＣＲ检测，检测其是否含有表达载体，结果如３－９图，泳道１、２、３、４、５含有Ｈ的条带，??表明该菌落含有已经构建好的载体，并从中选出最好的阳性菌落进行扩大培养，以便于对拟??南芥进行侵染。??２０??
【参考文献】：
期刊论文
[1]An ACCUMULATION AND REPLICATION OF CHLOROPLASTS 5 gene mutation confers light green peel in cucumber[J]. Qian Zhou,Shenhao Wang,Bowen Hu,Huiming Chen,Zhonghua Zhang,Sanwen Huang. Journal of Integrative Plant Biology. 2015(11)
[2]低氮胁迫对不同耐低氮性玉米品种苗期生长和生理特性的影响[J]. 李强,罗延宏,龙文靖,孔凡磊,杨世民,袁继超. 草业学报. 2014(04)
[3]黄瓜嫩果皮颜色的遗传研究[J]. 王建科,方小雪,李雪红,陈瑶,万正杰,徐跃进. 园艺学报. 2013(03)
[4]黄瓜白色果皮基因遗传规律及定位研究[J]. 董邵云,苗晗,张圣平,刘苗苗,王烨,顾兴芳. 西北植物学报. 2012(11)
[5]唐菖蒲丙二烯氧化物环化酶基因GhAOC的克隆与表达分析[J]. 连青龙,李晓昕,钟雄辉,尹义蕾,义鸣放. 中国农业大学学报. 2012(05)
[6]黄瓜果实相关性状QTL定位分析[J]. 苗晗,顾兴芳,张圣平,张忠华,黄三文,王烨,程周超,张若纬,穆生奇,李曼,张振贤,方智远. 中国农业科学. 2011(24)
[7]黄瓜无毛基因gl-2的遗传分析和定位[J]. 杨双娟,苗晗,张圣平,程周超,周健,董邵云,Todd C.Wehner,顾兴芳. 园艺学报. 2011(09)
[8]黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律及其AFLP标记研究[J]. 孙晓丹,商庆梅,秦智伟. 北方园艺. 2011(03)
[9]Chi基因的克隆及转基因马铃薯植株的获得[J]. 张茹,李金花,柴兆祥,张俊莲,张金文,王蒂. 草业学报. 2009(06)
[10]茉莉酸类化合物的合成研究进展[J]. 李祖光,李建亮,沈德隆. 浙江化工. 2008(09)
博士论文
[1]水稻耐低氮基因克隆与功能分析[D]. 张阳军.中国农业大学 2015
[2]大豆氮素利用效率相关基因的克隆及功能验证[D]. 郝青南.中国农业科学院 2013
[3]耐盐相关基因mangrin和ZRP4的克隆、分析与功能研究[D]. 张文惠.西北农林科技大学 2006
硕士论文
[1]长春花茉莉酸生物合成途径关键酶基因的克隆与表达分析[D]. 王名雪.上海交通大学 2013
[2]黄瓜固定标记图谱的构建及果皮光泽（D）、小刺（ss）性状定位及甘蓝抽薹性状基因的分子标记定位[D]. 杜辉.上海交通大学 2008
[3]红树林耐盐基因（AOC）的克隆及其转化热研五号柱花草的初步探讨[D]. 段瑞军.华南热带农业大学 2004
本文编号：3292413
【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３－３?蛋Ｈ保守结构域分析??
?１??０２??图３－４?ＣｓＡＯＣ３蛋Ｈ与其他植物ＡＯＣ蛋闩系统进化树分析??Ｆｉｇ．３－４?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＣｓＡＯＣ３?ｐｒｏｔｅｉｎ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?ｐｌａｎｔ?ＡＯＣ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??３．４?Ｃ＾４０Ｃ３在低氮胁迫条件下的表达分析??在播种３７?ｄ后对低氮处理和正常氮处理的两个黄瓜品系Ｄ０３２８和Ｄ０４２２第３片叶进行??取材，提取总ＲＮＡ，通过反转朵获得ｃＤＮＡ〇利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术对Ｄ０３２８和Ｄ０４２２两个响??应低氮能力不同的黄瓜品系在低氮和正常氮情况下表达情况进行了分析（图５）。??结果表明，和正常氮处理相比，响应低氮胁迫的黄瓜Ｄ０３２８在低氮胁迫条件件下ＣＭＯＣＪ的??表达景显著上调，增加了?１１倍之多；而对于响应低氮胁迫弱的黄瓜Ｄ０４２２，在低氮胁迫处理??和正常氮处理时Ｃ＾ＩＯＣＪ的表达量并没有明显变化（图５）。??１６
３．５．３质粒双酶切验证??对经过纯化回收的目的片段再用限制性内切酶；Ｉ和Ｉ对其进行双酶切鉴定。??ＰＣＲ结果显示如图３－８，泳道２、３为ＰＣＲ扩增出的耐低氮基因Ｃ＾ＯＣ？片段，进一步证明??Ｃ＾４（？Ｃ５基因已经成功转入表达载体。??．￥■?＇＾―ｉ??Ｍ：２ＫＭａｋｅｎ?２、３目的基因条带：丨、４：阴性对照??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?２Ｋ；?２，?３：?ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ?ｂａｎｄ；?１，４：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｐｌａｎｔ；??图３－８重组质粒双酶切验证??Ｆｉｇ?３－８?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｗａｓ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．５．４重组质粒导入根癌农杆菌??农杆菌是常用的植物遗传转化体系，又被称为“自然界最小的遗传工程师”，农杆菌介??疔法具有简便、高效、低拷Ｗ数等特点【７３］。本研究也试图通过农杆菌将ＲＮＡ干涉片段疔入??拟南芥中。因此，将ＰＢＩ１２１－Ｃ＾ＯＣＪ表达载体转入农奸菌是构建ＲＮＡ表达载体的关键一步。??本实验采用冷溶法制备感受态细胞，对已导入超表达载体质粒的农杆菌提取质粒ＤＮＡ，进行??ＰＣＲ检测，检测其是否含有表达载体，结果如３－９图，泳道１、２、３、４、５含有Ｈ的条带，??表明该菌落含有已经构建好的载体，并从中选出最好的阳性菌落进行扩大培养，以便于对拟??南芥进行侵染。??２０??
【参考文献】：
期刊论文
[1]An ACCUMULATION AND REPLICATION OF CHLOROPLASTS 5 gene mutation confers light green peel in cucumber[J]. Qian Zhou,Shenhao Wang,Bowen Hu,Huiming Chen,Zhonghua Zhang,Sanwen Huang. Journal of Integrative Plant Biology. 2015(11)
[2]低氮胁迫对不同耐低氮性玉米品种苗期生长和生理特性的影响[J]. 李强,罗延宏,龙文靖,孔凡磊,杨世民,袁继超. 草业学报. 2014(04)
[3]黄瓜嫩果皮颜色的遗传研究[J]. 王建科,方小雪,李雪红,陈瑶,万正杰,徐跃进. 园艺学报. 2013(03)
[4]黄瓜白色果皮基因遗传规律及定位研究[J]. 董邵云,苗晗,张圣平,刘苗苗,王烨,顾兴芳. 西北植物学报. 2012(11)
[5]唐菖蒲丙二烯氧化物环化酶基因GhAOC的克隆与表达分析[J]. 连青龙,李晓昕,钟雄辉,尹义蕾,义鸣放. 中国农业大学学报. 2012(05)
[6]黄瓜果实相关性状QTL定位分析[J]. 苗晗,顾兴芳,张圣平,张忠华,黄三文,王烨,程周超,张若纬,穆生奇,李曼,张振贤,方智远. 中国农业科学. 2011(24)
[7]黄瓜无毛基因gl-2的遗传分析和定位[J]. 杨双娟,苗晗,张圣平,程周超,周健,董邵云,Todd C.Wehner,顾兴芳. 园艺学报. 2011(09)
[8]黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律及其AFLP标记研究[J]. 孙晓丹,商庆梅,秦智伟. 北方园艺. 2011(03)
[9]Chi基因的克隆及转基因马铃薯植株的获得[J]. 张茹,李金花,柴兆祥,张俊莲,张金文,王蒂. 草业学报. 2009(06)
[10]茉莉酸类化合物的合成研究进展[J]. 李祖光,李建亮,沈德隆. 浙江化工. 2008(09)
博士论文
[1]水稻耐低氮基因克隆与功能分析[D]. 张阳军.中国农业大学 2015
[2]大豆氮素利用效率相关基因的克隆及功能验证[D]. 郝青南.中国农业科学院 2013
[3]耐盐相关基因mangrin和ZRP4的克隆、分析与功能研究[D]. 张文惠.西北农林科技大学 2006
硕士论文
[1]长春花茉莉酸生物合成途径关键酶基因的克隆与表达分析[D]. 王名雪.上海交通大学 2013
[2]黄瓜固定标记图谱的构建及果皮光泽（D）、小刺（ss）性状定位及甘蓝抽薹性状基因的分子标记定位[D]. 杜辉.上海交通大学 2008
[3]红树林耐盐基因（AOC）的克隆及其转化热研五号柱花草的初步探讨[D]. 段瑞军.华南热带农业大学 2004
本文编号：3292413
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