垂花百合花青素基因 ANS 启动子的克隆及功能分析
发布时间：2021-07-21 03:38
百合是世界著名多年生观赏花卉,其花枝挺拔、花型优美、花香迷人、花色丰富,深受世界人民喜爱,因此在鲜切花市场占有重要地位。虽然百合花色现有粉红色系、橙色系、白色等颜色,但蓝紫色百合花始终是人们向往的品种。花青素广泛分布于植物体内,可以使植物呈现红、蓝、紫、浅粉等颜色。其中花青素合成酶（anthocyanidin synthase, ANS,又称leucoanthocyanidin dioxygenase, LDOX）是花青素合成末期的关键酶,它可以将无色的花青素催化成有色的花青素,并且在大多数植物的花中特异性表达。因此研究花青素合成酶基因（ANS）启动子可以为通过基因工程手段改变花色奠定重要基础。本研究采用的植物材料是垂花百合花被片,垂花百合是我国原生种,其花被卷曲呈紫红色。我们将现有的LcANS基因启动子通过缺失的方法探究其上顺式作用元件的功能。主要结果如下：1.采用染色体步移法克隆得到垂花百合ANS基因启动子序列,通过生物信息学软件PLACE和PlantCARE等,在线分析ANS基因启动子上的顺式作用元件,发现启动子含有光响应元件BoI、ATCT-motif, AE-box、chs-...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
第一章 文献综述
1.1 高等植物启动子概述
1.1.1 高等植物启动子的概念
1.1.2 真核植物启动子的结构
1.1.3 启动子的分类
1.2 启动子的功能研究方法
1.2.1 启动子生物信息学分析
1.2.2 点突变分析
1.2.3 酵母单杂交技术
1.2.4 染色体免疫共沉淀法
1.2.5 凝胶阻滞分析实验(EMSA)
1.2.6 瞬时表达分析
1.2.7 稳定表达分析
1.2.8 缺失体分析
1.2.9 常用报告基因
1.3 花色相关基因启动子的研究进展
1.3.1 查尔酮合成酶(CHS)
1.3.2 查尔酮异构酶基因(CHI)
1.3.3 氢黄酮醇还原酶基因(DFR)
1.3.4 花青素合成酶(ANS)
1.3.5 类黄酮3’5’羟化酶基因(F3’5’H)
1.4 研究目的与意义
1.5 实验技术路线
第二章 ANS基因启动子的克隆与缺失融合载体的构建
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株与克隆载体
2.1.3 实验试剂
2.1.4 常用培养基的配置方法
2.2 实验方法
2.2.1 垂花百合基因组DNA的提取及纯化
2.2.2 特异性引物的设计
2.2.3 启动子序列的获得
2.2.4 获得ANS基因启动子缺失片段
2.2.5 缺失载体的构建
2.3 结果与分析
2.3.1 垂花百合基因组DNA的提取
2.3.2 染色体步移法克隆ANS基因启动子
2.3.3 ANS基因启动子5’端缺失片段的克隆
2.3.4 pMD18T-ANSpQ(1～5)重组质粒的酶切验证
2.3.5 重组表达载体的构建及检测
2.4 讨论
第三章 LcANSp基因启动子及缺失体在拟南芥中的遗传转化
3.1 材料
3.1.1 植物材料
3.1.2 菌株与质粒
3.1.3 试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 农杆菌工程菌的构建与鉴定
3.2.2 野生型拟南芥种子对硫酸卡那霉素(Kan)的敏感性检测
3.2.3 倒置浸花法转化拟南芥
3.2.4 硫酸卡那霉素筛选T_0代种子
3.2.5 T_0代抗性植株的PCR检测
3.2.6 T_2代抗性植株的获得
3.3 结果与分析
3.3.1 植物表达载体转化农杆菌
3.3.2 农杆菌工程菌的鉴定
3.3.3 野生型拟南芥对硫酸卡那霉素(Kan)的敏感性检测
3.3.4 T_0代转基因拟南芥的Kan抗性筛选
3.3.5 T_0代转基因拟南芥的PCR检测
3.3.6 T_2代转基因拟南芥的筛选
3.4 讨论
第四章 LcANSp启动子EMSA分析
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株与克隆载体
4.1.3 实验试剂
4.1.4 实验器材
4.2 实验方法
4.2.1 获得启动子片段
4.2.2 提取垂花百合花被片核蛋白
4.2.3 P1-P5系列DNA探针的标记
4.2.4 生物素标记探针标记效率的检测
4.2.5 EMSA胶的配制
4.2.6 EMSA结合反应
4.2.7 电泳
4.2.8 转膜
4.2.9 交联
4.2.10 化学发光检测
4.3 结果与分析
4.3.1 探针制备结果
4.3.2 垂花百合核蛋白与LcANSp启动子EMSA分析
4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表文章
【参考文献】：
期刊论文
[1]香水百合脱毒技术研究[J]. 刘艳妮. 宁夏农林科技. 2015(11)
[2]真核启动子研究进展[J]. 汤方,涂慧珍. 林业科技开发. 2015(02)
[3]植物启动子研究进展[J]. 李田,孙景宽,刘京涛. 生物技术通报. 2015(02)
[4]Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation[J]. LI Xiu-ying,LANG Zhi-hong,ZHANG Jie,HE Kang-lai,ZHU Li,HUANG Da-fang. Journal of Integrative Agriculture. 2014(05)
[5]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[6]植物诱导型启动子研究进展[J]. 孙芳芳,宋洪元. 南方园艺. 2014(02)
[7]激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1启动子活性的调节作用[J]. 阴霞,陈雯,王磊,杨若韵,薛璟祺,高俊平. 园艺学报. 2014(01)
[8]高羊茅FaChit1基因启动子的功能分析[J]. 王仕英,王浩如,王健. 植物科学学报. 2013(06)
[9]一个水稻鞘叶特异表达启动子的克隆及功能鉴定[J]. 颜彦,林拥军. 农业生物技术学报. 2013(07)
[10]马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析[J]. 瞿韵,张宁,常璟,晋昕,文义凯,司怀军,王蒂. 农业生物技术学报. 2013(07)
硕士论文
[1]拟南芥干旱诱导型启动子的克隆及功能分析[D]. 吴宪.吉林大学 2013
[2]紫花苜蓿MsZFN锌指蛋白基因启动子MsZPP的克隆与序列分析[D]. 李燕.内蒙古农业大学 2009
本文编号：3294227
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
英文摘要
第一章 文献综述
1.1 高等植物启动子概述
1.1.1 高等植物启动子的概念
1.1.2 真核植物启动子的结构
1.1.3 启动子的分类
1.2 启动子的功能研究方法
1.2.1 启动子生物信息学分析
1.2.2 点突变分析
1.2.3 酵母单杂交技术
1.2.4 染色体免疫共沉淀法
1.2.5 凝胶阻滞分析实验(EMSA)
1.2.6 瞬时表达分析
1.2.7 稳定表达分析
1.2.8 缺失体分析
1.2.9 常用报告基因
1.3 花色相关基因启动子的研究进展
1.3.1 查尔酮合成酶(CHS)
1.3.2 查尔酮异构酶基因(CHI)
1.3.3 氢黄酮醇还原酶基因(DFR)
1.3.4 花青素合成酶(ANS)
1.3.5 类黄酮3’5’羟化酶基因(F3’5’H)
1.4 研究目的与意义
1.5 实验技术路线
第二章 ANS基因启动子的克隆与缺失融合载体的构建
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株与克隆载体
2.1.3 实验试剂
2.1.4 常用培养基的配置方法
2.2 实验方法
2.2.1 垂花百合基因组DNA的提取及纯化
2.2.2 特异性引物的设计
2.2.3 启动子序列的获得
2.2.4 获得ANS基因启动子缺失片段
2.2.5 缺失载体的构建
2.3 结果与分析
2.3.1 垂花百合基因组DNA的提取
2.3.2 染色体步移法克隆ANS基因启动子
2.3.3 ANS基因启动子5’端缺失片段的克隆
2.3.4 pMD18T-ANSpQ(1～5)重组质粒的酶切验证
2.3.5 重组表达载体的构建及检测
2.4 讨论
第三章 LcANSp基因启动子及缺失体在拟南芥中的遗传转化
3.1 材料
3.1.1 植物材料
3.1.2 菌株与质粒
3.1.3 试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 农杆菌工程菌的构建与鉴定
3.2.2 野生型拟南芥种子对硫酸卡那霉素(Kan)的敏感性检测
3.2.3 倒置浸花法转化拟南芥
3.2.4 硫酸卡那霉素筛选T_0代种子
3.2.5 T_0代抗性植株的PCR检测
3.2.6 T_2代抗性植株的获得
3.3 结果与分析
3.3.1 植物表达载体转化农杆菌
3.3.2 农杆菌工程菌的鉴定
3.3.3 野生型拟南芥对硫酸卡那霉素(Kan)的敏感性检测
3.3.4 T_0代转基因拟南芥的Kan抗性筛选
3.3.5 T_0代转基因拟南芥的PCR检测
3.3.6 T_2代转基因拟南芥的筛选
3.4 讨论
第四章 LcANSp启动子EMSA分析
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株与克隆载体
4.1.3 实验试剂
4.1.4 实验器材
4.2 实验方法
4.2.1 获得启动子片段
4.2.2 提取垂花百合花被片核蛋白
4.2.3 P1-P5系列DNA探针的标记
4.2.4 生物素标记探针标记效率的检测
4.2.5 EMSA胶的配制
4.2.6 EMSA结合反应
4.2.7 电泳
4.2.8 转膜
4.2.9 交联
4.2.10 化学发光检测
4.3 结果与分析
4.3.1 探针制备结果
4.3.2 垂花百合核蛋白与LcANSp启动子EMSA分析
4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表文章
【参考文献】：
期刊论文
[1]香水百合脱毒技术研究[J]. 刘艳妮. 宁夏农林科技. 2015(11)
[2]真核启动子研究进展[J]. 汤方,涂慧珍. 林业科技开发. 2015(02)
[3]植物启动子研究进展[J]. 李田,孙景宽,刘京涛. 生物技术通报. 2015(02)
[4]Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation[J]. LI Xiu-ying,LANG Zhi-hong,ZHANG Jie,HE Kang-lai,ZHU Li,HUANG Da-fang. Journal of Integrative Agriculture. 2014(05)
[5]组织特异性启动子在作物基因工程中的研究进展[J]. 贺红霞,陈亮,林春晶,柳青. 中国农学通报. 2014(09)
[6]植物诱导型启动子研究进展[J]. 孙芳芳,宋洪元. 南方园艺. 2014(02)
[7]激素和非生物胁迫对月季RhPIP1;1启动子活性的调节作用[J]. 阴霞,陈雯,王磊,杨若韵,薛璟祺,高俊平. 园艺学报. 2014(01)
[8]高羊茅FaChit1基因启动子的功能分析[J]. 王仕英,王浩如,王健. 植物科学学报. 2013(06)
[9]一个水稻鞘叶特异表达启动子的克隆及功能鉴定[J]. 颜彦,林拥军. 农业生物技术学报. 2013(07)
[10]马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析[J]. 瞿韵,张宁,常璟,晋昕,文义凯,司怀军,王蒂. 农业生物技术学报. 2013(07)
硕士论文
[1]拟南芥干旱诱导型启动子的克隆及功能分析[D]. 吴宪.吉林大学 2013
[2]紫花苜蓿MsZFN锌指蛋白基因启动子MsZPP的克隆与序列分析[D]. 李燕.内蒙古农业大学 2009
本文编号：3294227
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