双靶向RNAi提高番茄抗病毒复合侵染能力的研究
发布时间：2021-07-21 18:46
番茄是茄科番茄属植物,作为食用蔬果全球广泛性种植。番茄病毒病严重影响番茄的产量及产品品质。其中烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒是番茄10多种主要毒源之首,普遍危害世界各番茄种植区,常以单独侵染或复合侵染形式危害植株。目前常用的方法是培育抗病品种或繁殖脱毒苗。RNA干涉技术作为基因工程技术之一,其应用优点逐步展现,因其高效特异性、可遗传性及生物安全性成为备受关注的抗病育种手段之一。试验依据RNA干扰机制构建针对TMV和CMV双靶向的RNA干涉双元载体系统。方法:以TMV、CMV病毒基因作为RNA干扰靶标基因,针对病毒株系间基因同源区域设计靶标基因目的序列引物。以复合感染TMV和CMV病毒的番茄叶片提取植物总RNA。经RT-PCR分别获得TMV和CMV的目的序列c DNA。介助T载体将两段靶序列连接成一条DNA序列。酶切后依次正向、反向锚定连接到PUCC-RNAi中间载体的克隆位点,形成靶序列在载体中的双向重复结构;酶切后插入到p C2300-35S-OCS表达载体中,重组质粒电击转化到根癌农杆菌感受态细胞中,完成RNAi双元载体系统的构建。选取无菌番茄幼苗的叶片和下胚轴为外植体,农杆菌介导法侵...
【文章来源】：牡丹江师范学院黑龙江省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第1章 引言
1.1 番茄病毒病害概述
1.2 番茄病毒病害防治的国内外研究现状
1.2.1 常规方法防治番茄病毒病原的研究进展
1.2.2 分子生物学技术在番茄病毒病害防治中的应用
1.3 课题的研究内容及研究目的和意义
1.3.1 主要研究内容
1.3.2 项目研究的目的和意义
第2章 RNAi载体构建及转基因番茄的培育
2.1 试验材料
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂及仪器设备
2.2 试验内容与方法
2.2.1 RNAi靶标基因引物设计及目的序列片段克隆
2.2.2 TMV和CMV目的序列的融合连接
2.2.3 RNAi载体构建
2.2.4 RNAi双元载体系统构建
2.2.5 根癌农杆菌介导外源RNAi载体对番茄的遗传转化
2.2.6 RNAi转基因番茄的抗性鉴定
第3章 结果与分析
3.0 番茄病毒病源验证
3.1 靶基因目的序列的克隆及RNAi双元载体构建
3.2 筛选的转化番茄PCR检测及病毒抗性鉴定
3.3 转基因番茄内非RNAi靶标基因荧光定量PCR验证
第4章 讨论
4.1 农杆菌侵染番茄过程中影响外源基因转化的因素
4.2 继代培养中选择压力对转化率的影响
4.3 影响转基因番茄表达抗病能力的因素
第5章 结论
参考文献
版图及版图说明
附录( 试剂配方 )
致谢
攻读学位期间发表论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]TMV和CMV病毒外壳蛋白基因双靶向的RNA干涉载体构建[J]. 尹蕾,唐凯悦,张跃新,李猷,律凤霞. 湖北农业科学. 2016(03)
[2]应用RNAi技术获得抗ToMV和CMV转基因烟草[J]. 林涛,郑银英,崔百明,乔亚红,向本春. 石河子大学学报(自然科学版). 2013(04)
[3]轮作不同蔬菜对大棚番茄连作基质中微生物与酶及后茬番茄的影响[J]. 李威,程智慧,孟焕文,周静,梁静,刘雪娇. 园艺学报. 2012(01)
[4]抗番茄花叶病毒RNAi载体转化加工番茄[J]. 苏建辉,向本春,郑银英,赵峰玉,王子华,王海燕,杨艳芹. 江苏农业学报. 2011(06)
[5]番茄病害的主要发生原因及综合防治措施[J]. 章恒毅. 现代农业科技. 2010(19)
[6]植物病毒病的发生与防治[J]. 郭万卓,谭丕和. 吉林蔬菜. 2010(02)
[7]番茄抗病基因分子标记研究进展[J]. 吴媛媛,李海涛,张子君,邹庆道. 贵州农业科学. 2010(02)
[8]番茄病毒病的症状、病原与药剂防治[J]. 王爱武,皇甫自起. 长江蔬菜. 2010(03)
[9]RNA interference and antiviral therapy[J]. Yan Ma, Chu-Yan Chan, Ming-Liang He, Stanley Ho Centre for Emerging Infectious Diseases, and Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China. World Journal of Gastroenterology. 2007(39)
[10]利用多重PCR反应同时筛选番茄Cf-9和Tm-1基因[J]. 宋燕,陈丽静,李君明,张智,李天来,徐和金,周永健. 植物遗传资源学报. 2006(02)
博士论文
[1]基于RNA干扰技术的加工番茄抗CMV、ToMV的研究[D]. 乔亚红.石河子大学 2013
[2]番茄RNA沉默体系的鉴定及其抗病毒新方法的研究[D]. 白描.湖南农业大学 2012
[3]黄瓜花叶病毒基因组表达与寄主microRNA的相关性研究[D]. 冯俊丽.浙江大学 2009
[4]转基因番茄标记基因剔除及翻译起始因子4E基因顺化植物的病毒抗性[D]. 张余洋.华中农业大学 2006
硕士论文
[1]利用RNA干扰技术提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D]. 李猷.牡丹江师范学院 2015
[2]我国主要烟区烟草黄瓜花叶病毒的鉴定及全基因组序列分析[D]. 金大伟.华中农业大学 2014
[3]烟草品种对烟草花叶病毒病和黄瓜花叶病毒病的抗病性鉴定研究[D]. 黄婷.西北农林科技大学 2012
[4]番茄黄化曲叶病毒病的防治效果及相关抗性基因的表达特征分析[D]. 何鑫.南京农业大学 2011
[5]烟草黄瓜花叶病毒病抗性遗传分析及其分子标记[D]. 范静苑.中国农业科学院 2009
[6]番茄四个抗病基因的基因标记的创建与辅助选择[D]. 孙亚林.华中农业大学 2008
[7]RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用[D]. 律凤霞.黑龙江八一农垦大学 2008
[8]辣椒抗黄瓜花叶病毒（CMV）遗传分析及ISSR分子标记筛选[D]. 吴小丽.扬州大学 2007
[9]烟草花叶病毒病的发生及化学防治机理研究[D]. 吕春霞.西北农林科技大学 2003
本文编号：3295573
【文章来源】：牡丹江师范学院黑龙江省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第1章 引言
1.1 番茄病毒病害概述
1.2 番茄病毒病害防治的国内外研究现状
1.2.1 常规方法防治番茄病毒病原的研究进展
1.2.2 分子生物学技术在番茄病毒病害防治中的应用
1.3 课题的研究内容及研究目的和意义
1.3.1 主要研究内容
1.3.2 项目研究的目的和意义
第2章 RNAi载体构建及转基因番茄的培育
2.1 试验材料
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂及仪器设备
2.2 试验内容与方法
2.2.1 RNAi靶标基因引物设计及目的序列片段克隆
2.2.2 TMV和CMV目的序列的融合连接
2.2.3 RNAi载体构建
2.2.4 RNAi双元载体系统构建
2.2.5 根癌农杆菌介导外源RNAi载体对番茄的遗传转化
2.2.6 RNAi转基因番茄的抗性鉴定
第3章 结果与分析
3.0 番茄病毒病源验证
3.1 靶基因目的序列的克隆及RNAi双元载体构建
3.2 筛选的转化番茄PCR检测及病毒抗性鉴定
3.3 转基因番茄内非RNAi靶标基因荧光定量PCR验证
第4章 讨论
4.1 农杆菌侵染番茄过程中影响外源基因转化的因素
4.2 继代培养中选择压力对转化率的影响
4.3 影响转基因番茄表达抗病能力的因素
第5章 结论
参考文献
版图及版图说明
附录( 试剂配方 )
致谢
攻读学位期间发表论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]TMV和CMV病毒外壳蛋白基因双靶向的RNA干涉载体构建[J]. 尹蕾,唐凯悦,张跃新,李猷,律凤霞. 湖北农业科学. 2016(03)
[2]应用RNAi技术获得抗ToMV和CMV转基因烟草[J]. 林涛,郑银英,崔百明,乔亚红,向本春. 石河子大学学报(自然科学版). 2013(04)
[3]轮作不同蔬菜对大棚番茄连作基质中微生物与酶及后茬番茄的影响[J]. 李威,程智慧,孟焕文,周静,梁静,刘雪娇. 园艺学报. 2012(01)
[4]抗番茄花叶病毒RNAi载体转化加工番茄[J]. 苏建辉,向本春,郑银英,赵峰玉,王子华,王海燕,杨艳芹. 江苏农业学报. 2011(06)
[5]番茄病害的主要发生原因及综合防治措施[J]. 章恒毅. 现代农业科技. 2010(19)
[6]植物病毒病的发生与防治[J]. 郭万卓,谭丕和. 吉林蔬菜. 2010(02)
[7]番茄抗病基因分子标记研究进展[J]. 吴媛媛,李海涛,张子君,邹庆道. 贵州农业科学. 2010(02)
[8]番茄病毒病的症状、病原与药剂防治[J]. 王爱武,皇甫自起. 长江蔬菜. 2010(03)
[9]RNA interference and antiviral therapy[J]. Yan Ma, Chu-Yan Chan, Ming-Liang He, Stanley Ho Centre for Emerging Infectious Diseases, and Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China. World Journal of Gastroenterology. 2007(39)
[10]利用多重PCR反应同时筛选番茄Cf-9和Tm-1基因[J]. 宋燕,陈丽静,李君明,张智,李天来,徐和金,周永健. 植物遗传资源学报. 2006(02)
博士论文
[1]基于RNA干扰技术的加工番茄抗CMV、ToMV的研究[D]. 乔亚红.石河子大学 2013
[2]番茄RNA沉默体系的鉴定及其抗病毒新方法的研究[D]. 白描.湖南农业大学 2012
[3]黄瓜花叶病毒基因组表达与寄主microRNA的相关性研究[D]. 冯俊丽.浙江大学 2009
[4]转基因番茄标记基因剔除及翻译起始因子4E基因顺化植物的病毒抗性[D]. 张余洋.华中农业大学 2006
硕士论文
[1]利用RNA干扰技术提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D]. 李猷.牡丹江师范学院 2015
[2]我国主要烟区烟草黄瓜花叶病毒的鉴定及全基因组序列分析[D]. 金大伟.华中农业大学 2014
[3]烟草品种对烟草花叶病毒病和黄瓜花叶病毒病的抗病性鉴定研究[D]. 黄婷.西北农林科技大学 2012
[4]番茄黄化曲叶病毒病的防治效果及相关抗性基因的表达特征分析[D]. 何鑫.南京农业大学 2011
[5]烟草黄瓜花叶病毒病抗性遗传分析及其分子标记[D]. 范静苑.中国农业科学院 2009
[6]番茄四个抗病基因的基因标记的创建与辅助选择[D]. 孙亚林.华中农业大学 2008
[7]RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用[D]. 律凤霞.黑龙江八一农垦大学 2008
[8]辣椒抗黄瓜花叶病毒（CMV）遗传分析及ISSR分子标记筛选[D]. 吴小丽.扬州大学 2007
[9]烟草花叶病毒病的发生及化学防治机理研究[D]. 吕春霞.西北农林科技大学 2003
本文编号：3295573
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