生菜散种与叶色性状的遗传分析及基因定位
发布时间：2021-07-21 20:35
散种（shattering）是指植物的种子成熟后,种子从植株上脱落的特性。在豆科、禾本科等植物中散种的调控机制已有深入研究,而在菊科植物中相关研究较少,散种调控机理还未知。为定位克隆生菜中控制散种性状的基因,实验室利用已有的栽培生菜W111（不散种）和野生生菜PI491245（散种）杂交后自交获得F2代散种分离群体,该表型分离比符合孟德尔分离定律（散种:不散≈3:1）。利用该群体定位调控散种性状的候选基因。根据实验室已有分离群体,将控制散种性状的目的基因定位在6号染色体9.280Mb～17.002Mb之间,约7.72Mb。利用RNA测序的240份莴苣材料进行关联分析,结合功能注释,预测LG6581050与LG6580947为控制生菜散种性状的候选基因,它们的功能分别是乙烯相关因子和多聚半乳糖醛酸酶的。分析候选基因的表达量,LG6581050在生菜花托和苞片的表达量高于其他组织,而LG6580947在生菜的不同组织中都有表达。对散种近等基因系材料的总苞和花托进行了乙烯和细胞壁成分进行分析,发现乙烯含量在不散种和散种材料中无明显差异,而纤维素和果胶在不散种材料中显著高...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
落粒性基因的调控解析(苟亚军等,2019)
生菜散种性状与叶片红色深浅的基因定位及遗传分析5图2拟南芥离层区发育的调控网络。红色箭头，基因正调控；黑色虚线箭头，基因负调控；方括号，多个基因负调控(Vittorietal.,2019)Fig.2TheregulatorynetworkforthedifferentiationoftissuesthatarenecessaryforpoddehiscenceinArabidopsis.Redarrows,positivegeneregulation;blackdashedarrows,negativegeneregulation;squarebrackets,negativeregulationonmorethanonegene(Vittorietal.,2019)1.1.3.5激素对种子脱落的作用植物激素是植物体内的信号分子，能调控植物的生长发育。脱落酸在种子等器官的脱落中起直接作用(Xieetal.,2017)。生长素含量的高低会影响种子的落粒性，例如在拟南芥中，瓣膜边缘分离层中生长素含量达到最低限度会引起IND基因的表达，促进种子的脱落(Sorefanetal.,2009)。SPAT-ULA(SPT)基因是一个bHLH转录因子，是生殖器官发育所必需的，IND和SPT参与调节瓣膜边缘生长素的转运，并相互作用调控离层区的形成(Girinetal.,2011)。植物激素细胞分裂素在雌蕊、果实形态和形态建成中起重要作用，细胞分裂素和生长素在植物生长发育过程中有拮抗作用(Marschmartinezetal.,2012)。研究表明，细胞分裂素信号途径活跃于瓣膜边缘，细胞分裂素对于瓣膜边缘细胞的分化具有重要作用，在shp1/2和ind突变体中，未成熟的果实的细胞分裂素可以促进瓣膜边缘细胞的形成(Klee,2004)，进而促进果荚的开裂。乙烯作为植物激素，可以调节花和种子的脱落，乙烯含量的增加通常与组织衰老和细胞应激有关。乙烯转录因子（ETR1、EIN2、EIN3）在离层形成中起作用，能促进离层的发育。此外，乙烯是生长素的有效抑制剂，乙烯和生长素之间的平衡和相互作用可能是调控和决定脱落的关键因素(Xieetal.,2017)。赤霉
生菜散种性状与叶片红色深浅的基因定位及遗传分析111.2.2.10.1超表达载体构建为验证候选基因的功能，构建了候选基因的超量表达载体。扩增目的基因全长，从ATG开始到终止密码子，在正引物的5’端加上接头序列：CAAGTTCTTCACTGTTGATACATATG，在反向引物的5’端加上接头序列：CCCGGGGTCGACGGGCATATG，以cDNA为模版进行扩增，用高保真酶（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行PCR扩增，获得外源片段。将NdeI酶切后的PRI101-GFP载体（图3）与外源片段进行同源重组（同源重组的方法见附录2），同源重组产物转化大肠杆菌Trans-T1感受态（北京全式金生物技术公司），利用Pri101-F/R引物检测大肠杆菌菌落，检测获得的阳性单克隆，送公司进行测序（武汉天一辉远生物科技有限公司），对序列正确的阳性菌落进行菌液保存与质粒提取，质粒转化农杆菌感受态GV3101（上海唯地生物技术有限公司），利用Pri101-F/R引物检测农杆菌菌落，阳性菌落加入50%甘油保存于-80℃。图3PRI-101-GFP载体示意图Fig.3PRI-101-GFPVectorsketch1.2.2.10.2CRISPR敲除载体构建为进一步验证候选基因的功能，构建候选基因敲除载体，进行遗传转化，观察转基因阳性苗表型。敲除载体构建：利用华中农业大学建立的gRNA设计网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，将目的基因LG6581050与LG6580947的cDNA序列导入该网址，设计gRNA。在gRNA两头加上引物接头，其中以gRNA2反向序列加上相应接头作为反向引物，以质粒pCBC-DT1T2为模板使用高保真酶扩增目的序列。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否正确，将正确的PCR产物与BsaI酶切好的PKSE401载体进行同源重组（图4），同源重组产物转化大肠杆菌Trans-T1感受态（北京全式金生物技术公司），利用引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]广东雷州杂草稻sh4和qSH1基因的功能SNP位点序列分析[J]. 夏启玉,曹扬,孔华,李美英,张丽丽,贺萍萍,张雨良,郭安平. 热带作物学报. 2020(01)
[2]水稻落粒性的研究进展[J]. 苟亚军,杨维丰,林少俊,高彦昊,栾鑫. 中国水稻科学. 2019(06)
[3]UV-A和UV-B提高甘蓝幼苗花青素含量以及调控基因表达分析[J]. 齐艳,邢燕霞,郑禾,孙倩倩,李殿波,王晋芳,石锦,赵冰,郭仰东. 中国农业大学学报. 2014(02)
[4]植物花青素合成相关的bHLH转录因子[J]. 杨鹏程,周波,李玉花. 植物生理学报. 2012(08)
[5]环境因子调控植物花青素苷合成及呈色的机理[J]. 胡可,韩科厅,戴思兰. 植物学报. 2010(03)
[6]重复序列及异染色质化在植物性染色体重组抑制中的作用[J]. 高武军,谢璐,卢靖雯,邓传良,卢龙斗. 遗传. 2010(01)
[7]植物器官脱落分子生物学研究进展[J]. 王翔,陈晓博,李爱丽,毛龙. 作物学报. 2009(03)
[8]植物花青素代谢途径分析及调控模型建立[J]. 张宁,胡宗利,陈绪清,侯晓姝,李勇,陈国平. 中国生物工程杂志. 2008(01)
[9]植物花青素生物合成中的调控基因[J]. 刘仕芸,黄艳岚,张树珍. 植物生理学通讯. 2006(04)
[10]气相色谱法速测翠冠梨中乙烯含量[J]. 吴友根,陈金印,庞会忠,朱俊英. 现代化农业. 2003(03)
硕士论文
[1]裸燕麦落粒性相关AnQ基因的克隆和表达特性研究[D]. 张凯.内蒙古农业大学 2019
[2]生菜叶片红色调控基因的克隆与功能验证[D]. 赵冬梅.华中农业大学 2018
本文编号：3295730
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
落粒性基因的调控解析(苟亚军等,2019)
生菜散种性状与叶片红色深浅的基因定位及遗传分析5图2拟南芥离层区发育的调控网络。红色箭头，基因正调控；黑色虚线箭头，基因负调控；方括号，多个基因负调控(Vittorietal.,2019)Fig.2TheregulatorynetworkforthedifferentiationoftissuesthatarenecessaryforpoddehiscenceinArabidopsis.Redarrows,positivegeneregulation;blackdashedarrows,negativegeneregulation;squarebrackets,negativeregulationonmorethanonegene(Vittorietal.,2019)1.1.3.5激素对种子脱落的作用植物激素是植物体内的信号分子，能调控植物的生长发育。脱落酸在种子等器官的脱落中起直接作用(Xieetal.,2017)。生长素含量的高低会影响种子的落粒性，例如在拟南芥中，瓣膜边缘分离层中生长素含量达到最低限度会引起IND基因的表达，促进种子的脱落(Sorefanetal.,2009)。SPAT-ULA(SPT)基因是一个bHLH转录因子，是生殖器官发育所必需的，IND和SPT参与调节瓣膜边缘生长素的转运，并相互作用调控离层区的形成(Girinetal.,2011)。植物激素细胞分裂素在雌蕊、果实形态和形态建成中起重要作用，细胞分裂素和生长素在植物生长发育过程中有拮抗作用(Marschmartinezetal.,2012)。研究表明，细胞分裂素信号途径活跃于瓣膜边缘，细胞分裂素对于瓣膜边缘细胞的分化具有重要作用，在shp1/2和ind突变体中，未成熟的果实的细胞分裂素可以促进瓣膜边缘细胞的形成(Klee,2004)，进而促进果荚的开裂。乙烯作为植物激素，可以调节花和种子的脱落，乙烯含量的增加通常与组织衰老和细胞应激有关。乙烯转录因子（ETR1、EIN2、EIN3）在离层形成中起作用，能促进离层的发育。此外，乙烯是生长素的有效抑制剂，乙烯和生长素之间的平衡和相互作用可能是调控和决定脱落的关键因素(Xieetal.,2017)。赤霉
生菜散种性状与叶片红色深浅的基因定位及遗传分析111.2.2.10.1超表达载体构建为验证候选基因的功能，构建了候选基因的超量表达载体。扩增目的基因全长，从ATG开始到终止密码子，在正引物的5’端加上接头序列：CAAGTTCTTCACTGTTGATACATATG，在反向引物的5’端加上接头序列：CCCGGGGTCGACGGGCATATG，以cDNA为模版进行扩增，用高保真酶（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行PCR扩增，获得外源片段。将NdeI酶切后的PRI101-GFP载体（图3）与外源片段进行同源重组（同源重组的方法见附录2），同源重组产物转化大肠杆菌Trans-T1感受态（北京全式金生物技术公司），利用Pri101-F/R引物检测大肠杆菌菌落，检测获得的阳性单克隆，送公司进行测序（武汉天一辉远生物科技有限公司），对序列正确的阳性菌落进行菌液保存与质粒提取，质粒转化农杆菌感受态GV3101（上海唯地生物技术有限公司），利用Pri101-F/R引物检测农杆菌菌落，阳性菌落加入50%甘油保存于-80℃。图3PRI-101-GFP载体示意图Fig.3PRI-101-GFPVectorsketch1.2.2.10.2CRISPR敲除载体构建为进一步验证候选基因的功能，构建候选基因敲除载体，进行遗传转化，观察转基因阳性苗表型。敲除载体构建：利用华中农业大学建立的gRNA设计网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，将目的基因LG6581050与LG6580947的cDNA序列导入该网址，设计gRNA。在gRNA两头加上引物接头，其中以gRNA2反向序列加上相应接头作为反向引物，以质粒pCBC-DT1T2为模板使用高保真酶扩增目的序列。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否正确，将正确的PCR产物与BsaI酶切好的PKSE401载体进行同源重组（图4），同源重组产物转化大肠杆菌Trans-T1感受态（北京全式金生物技术公司），利用引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]广东雷州杂草稻sh4和qSH1基因的功能SNP位点序列分析[J]. 夏启玉,曹扬,孔华,李美英,张丽丽,贺萍萍,张雨良,郭安平. 热带作物学报. 2020(01)
[2]水稻落粒性的研究进展[J]. 苟亚军,杨维丰,林少俊,高彦昊,栾鑫. 中国水稻科学. 2019(06)
[3]UV-A和UV-B提高甘蓝幼苗花青素含量以及调控基因表达分析[J]. 齐艳,邢燕霞,郑禾,孙倩倩,李殿波,王晋芳,石锦,赵冰,郭仰东. 中国农业大学学报. 2014(02)
[4]植物花青素合成相关的bHLH转录因子[J]. 杨鹏程,周波,李玉花. 植物生理学报. 2012(08)
[5]环境因子调控植物花青素苷合成及呈色的机理[J]. 胡可,韩科厅,戴思兰. 植物学报. 2010(03)
[6]重复序列及异染色质化在植物性染色体重组抑制中的作用[J]. 高武军,谢璐,卢靖雯,邓传良,卢龙斗. 遗传. 2010(01)
[7]植物器官脱落分子生物学研究进展[J]. 王翔,陈晓博,李爱丽,毛龙. 作物学报. 2009(03)
[8]植物花青素代谢途径分析及调控模型建立[J]. 张宁,胡宗利,陈绪清,侯晓姝,李勇,陈国平. 中国生物工程杂志. 2008(01)
[9]植物花青素生物合成中的调控基因[J]. 刘仕芸,黄艳岚,张树珍. 植物生理学通讯. 2006(04)
[10]气相色谱法速测翠冠梨中乙烯含量[J]. 吴友根,陈金印,庞会忠,朱俊英. 现代化农业. 2003(03)
硕士论文
[1]裸燕麦落粒性相关AnQ基因的克隆和表达特性研究[D]. 张凯.内蒙古农业大学 2019
[2]生菜叶片红色调控基因的克隆与功能验证[D]. 赵冬梅.华中农业大学 2018
本文编号：3295730
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