蜻蜓凤梨AfPIF4基因的克隆与功能鉴定
发布时间：2021-07-22 18:49
蜻蜓凤梨（Aechmea fasciata）隶属凤梨科,为多年生草本单子叶植物,具有非常高的观赏价值,深受人们的喜爱。但是由于其营养生长期较长,所以人们一直通过控制栽培环境的温度、光照时间和使用乙烯等激素条件调控其开花时间以满足市场的需求,但截至目前,蜻蜓凤梨的开花机理尚不清楚,导致人工催花效果不十分理想。为了解析蜻蜓凤梨开花机理,本研究根据转录组中的片段信息,利用cDNA 快速末端扩增（Rapid amplification of cDNA end,RACE）的技术从蜻蜓凤梨中获得一个光敏色素因子（PIFs）的cDNA全长序列,并将其命名为AfPIF4。AfPIF4基因cDNA全长1 343 bp,开放阅读框为1296 bp,编码431个氨基酸。利用NCBI分析氨基酸序列结果显示:AfPIF4含有bHLH蛋白家族共有的功能结构域bHLH,与海枣（Phoenix dactylifera）,大豆（Glycine max）,玉米（Zea mays）,番茄（Solanum lycopersicum）中的 PIF 同源性分别为52%,49%,42%,39%。进化树分析显示AfPIF4与小果野芭...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１：转录因子激活报告基因原理??Ｆｉｇｕｒｅ?１：?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｆａｃｔｏｒｓ?ａｃｔｉｖａｔｅ?ｒｅｐｏｒｔ?ｇｅｎｅ??
２．２．２．１蜻蜓凤梨材料的选取??组织特异性样品的采集：分别选取生长温室大棚内，温度控制在２５－３０°Ｃ的生长??健壮，无病害的盆栽幼株，成株（图２），２种材料各取３株。将每株的外围叶剥掉，??分离根，茎，心叶，外叶；为了进一步研究Ｊ／Ｐ／ｆＶ在蜻蜓凤梨幼株和成株对乙烯的??响应，我们使用乙烯对其进行了不同时间的处理：〇ｈ，?ｌｈ，６ｈ，?２４ｈ取其茎尖，用清??水清洗干净，放置于采样管，液弒速冻，－８（ＴＣ保存。??图２：蜻蜓凤梨材料??注：Ａ：小株；Ｂ：成株；Ｃ：开花植株??Ｖ＇ｘ＾ｕｈｙＩ：?Ａｅｃｈｍｅａ?ｆａｓｃｉａｔｄ?｜）ｌａｎｔｓ??Ｎｏｔｅ：?Ａ：?Ｊｕｖｅｎｉｌｅ?ｐｌａｎ！；?Ｂ：?Ｍｉｉｌｕｒｃ?ｐｈｉｎｌ；?Ｃ：?Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ?ｐｌｎｎｌ??１７??
３．１．１蜻蜓凤梨ＲＮＡ的提取??本研究提取蜻蜓凤梨心叶的总ＲＮＡ，测其ＯＤ２６Ｇ／２８（）比值分别为１．９９０９，?１．８９９１，??１．９８０５，均在１．８？２．０范围内，琼脂糖凝胶电泳显示结果（图３），质量达到后续所??需。??１?２?３??＊２８Ｓ??１８Ｓ??图３：蜻蜓凤梨心叶总ＲＮＡ的琼脂糖凝胶电泳图谱??注：１－３：蜻蜓凤梨３株心叶ＲＮＡ??Ｆｉｇｕｒｅ?３：?Ａｇｒｏｓｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ?ｏｉＡ．?ｆａｓｃｉａｔａ??Ｎｏｔｅ：?１－３：?Ｔｈｅ?ＲＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｃｅｎｔｒａｌ?ｌｅａｖｅｓ?ｏｉ?Ａ．?ｆａｓｃｉａｔａ??３．１．２?４／Ｐ／ｉＷ基因的克隆??３．１．２．?Ｍ／Ｐ／Ｆ４基因编码区序列的获得??我们通过ＲＡＣＥ技术获得了?的５＇端序列５２８?ｂｐ?（图５Ａ）和３１端序??列１?Ｉ９０ｂｐ?（图５Ｂ），根据所得ｃＤＮＡ片段，寻找ｊ／Ｐ／ｆＶ的开放阅读框为１２９６??ｂｐ，推测其编码了?４３１个氨基酸（图４），据此再次设计带有Ｋｐｎｌ和Ｘｂａｌ酶切位点??的特异性引物，利用ＰＣＲ技术扩增得到目的片段（图５Ｃ），测序结果显示与ＲＡＣＥ??拼接序列相同
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛大力总RNA提取的CTAB法改进及优化[J]. 郝宏刚,李志英,丛汉卿,徐立. 广东农业科学. 2012(18)
[2]生长素合成途径的研究进展[J]. 王家利,刘冬成,郭小丽,张爱民. 植物学报. 2012(03)
[3]受乙烯诱导表达的蜻蜓凤梨MAPKK基因的克隆与序列分析[J]. 张鲲,徐立,丛汉卿,丁静,郝宏刚,李志英. 热带生物学报. 2011(02)
[4]植物基因的遗传转化方法[J]. 钟育海,申艮宝. 安徽农学通报(上半月刊). 2010(11)
[5]观赏凤梨组培快繁技术研究进展[J]. 龚明霞,何铁光,黄如葵,方峰. 广西农业科学. 2010(05)
[6]甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用[J]. 杨彩云,尹伟伦,夏新莉. 分子植物育种. 2009(06)
[7]凤梨类植物的种质资源与分类[J]. 何业华,胡中沂,马均,方少秋,卢敏,谢志亮,彭兵. 经济林研究. 2009(03)
[8]观赏凤梨乙烯催花机理的研究进展[J]. 信彩云,李志英. 热带农业科学. 2009(02)
[9]观赏凤梨生物技术研究进展(综述)[J]. 刘慧春,潘晓韵,朱开元,王炜勇. 亚热带植物科学. 2007(04)
[10]凤梨亚科光萼荷属与其近源属亲缘关系的ISSR分子鉴定[J]. 李萍,石金磊,胡永红,陈醇,蒋昌华,王佳,明凤. 种子. 2007(11)
本文编号：3297699
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１：转录因子激活报告基因原理??Ｆｉｇｕｒｅ?１：?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｆａｃｔｏｒｓ?ａｃｔｉｖａｔｅ?ｒｅｐｏｒｔ?ｇｅｎｅ??
２．２．２．１蜻蜓凤梨材料的选取??组织特异性样品的采集：分别选取生长温室大棚内，温度控制在２５－３０°Ｃ的生长??健壮，无病害的盆栽幼株，成株（图２），２种材料各取３株。将每株的外围叶剥掉，??分离根，茎，心叶，外叶；为了进一步研究Ｊ／Ｐ／ｆＶ在蜻蜓凤梨幼株和成株对乙烯的??响应，我们使用乙烯对其进行了不同时间的处理：〇ｈ，?ｌｈ，６ｈ，?２４ｈ取其茎尖，用清??水清洗干净，放置于采样管，液弒速冻，－８（ＴＣ保存。??图２：蜻蜓凤梨材料??注：Ａ：小株；Ｂ：成株；Ｃ：开花植株??Ｖ＇ｘ＾ｕｈｙＩ：?Ａｅｃｈｍｅａ?ｆａｓｃｉａｔｄ?｜）ｌａｎｔｓ??Ｎｏｔｅ：?Ａ：?Ｊｕｖｅｎｉｌｅ?ｐｌａｎ！；?Ｂ：?Ｍｉｉｌｕｒｃ?ｐｈｉｎｌ；?Ｃ：?Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ?ｐｌｎｎｌ??１７??
３．１．１蜻蜓凤梨ＲＮＡ的提取??本研究提取蜻蜓凤梨心叶的总ＲＮＡ，测其ＯＤ２６Ｇ／２８（）比值分别为１．９９０９，?１．８９９１，??１．９８０５，均在１．８？２．０范围内，琼脂糖凝胶电泳显示结果（图３），质量达到后续所??需。??１?２?３??＊２８Ｓ??１８Ｓ??图３：蜻蜓凤梨心叶总ＲＮＡ的琼脂糖凝胶电泳图谱??注：１－３：蜻蜓凤梨３株心叶ＲＮＡ??Ｆｉｇｕｒｅ?３：?Ａｇｒｏｓｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ?ｏｉＡ．?ｆａｓｃｉａｔａ??Ｎｏｔｅ：?１－３：?Ｔｈｅ?ＲＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｃｅｎｔｒａｌ?ｌｅａｖｅｓ?ｏｉ?Ａ．?ｆａｓｃｉａｔａ??３．１．２?４／Ｐ／ｉＷ基因的克隆??３．１．２．?Ｍ／Ｐ／Ｆ４基因编码区序列的获得??我们通过ＲＡＣＥ技术获得了?的５＇端序列５２８?ｂｐ?（图５Ａ）和３１端序??列１?Ｉ９０ｂｐ?（图５Ｂ），根据所得ｃＤＮＡ片段，寻找ｊ／Ｐ／ｆＶ的开放阅读框为１２９６??ｂｐ，推测其编码了?４３１个氨基酸（图４），据此再次设计带有Ｋｐｎｌ和Ｘｂａｌ酶切位点??的特异性引物，利用ＰＣＲ技术扩增得到目的片段（图５Ｃ），测序结果显示与ＲＡＣＥ??拼接序列相同
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛大力总RNA提取的CTAB法改进及优化[J]. 郝宏刚,李志英,丛汉卿,徐立. 广东农业科学. 2012(18)
[2]生长素合成途径的研究进展[J]. 王家利,刘冬成,郭小丽,张爱民. 植物学报. 2012(03)
[3]受乙烯诱导表达的蜻蜓凤梨MAPKK基因的克隆与序列分析[J]. 张鲲,徐立,丛汉卿,丁静,郝宏刚,李志英. 热带生物学报. 2011(02)
[4]植物基因的遗传转化方法[J]. 钟育海,申艮宝. 安徽农学通报(上半月刊). 2010(11)
[5]观赏凤梨组培快繁技术研究进展[J]. 龚明霞,何铁光,黄如葵,方峰. 广西农业科学. 2010(05)
[6]甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用[J]. 杨彩云,尹伟伦,夏新莉. 分子植物育种. 2009(06)
[7]凤梨类植物的种质资源与分类[J]. 何业华,胡中沂,马均,方少秋,卢敏,谢志亮,彭兵. 经济林研究. 2009(03)
[8]观赏凤梨乙烯催花机理的研究进展[J]. 信彩云,李志英. 热带农业科学. 2009(02)
[9]观赏凤梨生物技术研究进展(综述)[J]. 刘慧春,潘晓韵,朱开元,王炜勇. 亚热带植物科学. 2007(04)
[10]凤梨亚科光萼荷属与其近源属亲缘关系的ISSR分子鉴定[J]. 李萍,石金磊,胡永红,陈醇,蒋昌华,王佳,明凤. 种子. 2007(11)
本文编号：3297699
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