辣椒及大蒜病毒多重RT-PCR检测体系的建立
发布时间：2021-08-11 22:58
辣椒、大蒜均具有较高的营养价值和独特的风味,是蔬菜作物和调味品之一,但辣椒病毒病广泛发生,造成减产30%-50%甚至绝收；大蒜无性繁殖过程中病毒可在植物体内逐代积累,导致种性退化。辣椒、大蒜的病毒病防治,需要有快速、有效的检测方法,以确定病毒感染情况或脱毒效果与质量。本研究以辣椒的烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus,TMW）、黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus, CMV）、马铃薯Y病毒（Potato Virus Y, PVY）、蚕豆萎蔫病毒-2 （Broad Bean Vascula Wilt Virus-2, BBWV-2）和大蒜的韭葱黄条病毒（Leek Yellow Stripe Virus, LYSV）、洋葱黄矮病毒（Onion Yellow Dwarf Virus, OYDV）、葱潜隐病毒（Shallot Latent Virus, SLV）、青葱X病毒属病毒（Allexiviruses）为研究对象,分别建立了四重RT-PCR检测体系,并用这两个体系分别对湖南辣椒、大蒜病毒发生情况进行了研究。此外,对湖南长沙、茶陵Allexivirus...
【文章来源】：湖南农业大学湖南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
疑似感病辣椒FYg1symptomofsuspectedpepper
２．３．１辣椒叶片总ＲＮＡ提取??Ｗ湖南省长沙市湖南农业大学蔬菜基地、株洲市體陵县辣椒主产区疑似感病辣椒??叶片为材料（图１），提取总ＲＮＡ，通过１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测提取结果（图２），??结果表明，能清晰地看到总ＲＮＡ的２８Ｓ、１８Ｓ条带，且条带没有出现明显弥散，ＲＮＡ完??整性较好，能被后续实验使用。??Ｈ??图１疑似感病辣椒??Ｆｉｇ?１?ｓｙｍｐ化ｍ?ｏｆ?ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ?ｐｅｐｐｅｒ??１７??
椒病毒单重ＲＴ－ＰＣ民检测体系的建立??据北京全式金生物有限公司ＰＣＲ扩增试剂２?Ｘ?Ｔａｑ?Ｍａｓｔｅｒ?Ｍｉｘ常用的ＰＣＲ反应体??行辣椒ＴＳＷＶ、ＣＭＶ、ＴＭＶ、ＰＶＹ和ＢＢＷＶ－２单重ＰＣＲ扩增，针对扩增的结果，??ＰＣＲ反应的种种因素（如ＰＣＲ反应循环数、引物浓度等）进行适当调整，由不度的实验得出最适宜的退火温度，通过比较试验结果确定最佳单重ＰＣＲ反应体??序。单重ＰＣＲ体系组分包括２ＸＴａｑ?Ｍａｓｔｅｒ?Ｍｉｘ?１２．５?ＵＬ，上、下游特异性引物??，模板ＣＤＮＡ２?＂Ｌ，?ｄｄＥｂＱ补足至２５?ＵＬ。单重ＰＣ民反应程序为；９４°Ｃ预变９４°Ｃ变性３０ｓ；?５７’Ｃ退火３０ｓ；?７２°Ｃ延伸Ｉｍｉｎ；循环数为３５；最后７２°Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ用该体系对疑似感病辣椒样品进行单重ＲＴ－ＰＣＲ扩增，单重ＰＣ民扩增引物序列果表明，不能从样品中扩增出大小为２５化Ｐ?（ＴＳＷＶ）的特异性条带，能扩增??为３２３ｂｐ?（ＣＭＶ）、２巧?ｂｐ?（ＴＭＶ）、４８０ｂｐ?（ＰＶＹ）和?１０５７ｂｐ?（ＢＢＷＶ－２）条带，条带大小与试验设计相符，见图３、４、５、６，说明样品未被ＴＳＷＶ侵染，ＣＭＶ、ＴＭＶ、ＰＶＹ和ＢＢＷＶ－２侵染。运用该体系筛选出被ＣＭＶ、ＴＭＶ、ＰＶＹ??Ｖ－２四种病毒复合侵染的辣椒样品。??Ｍ?１?２?３?４?５?６?７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]贵州辣椒病毒病的种类检测[J]. 王莉爽,陈文,谭清群,陈小均,吴石平,何海永,杨学辉. 贵州农业科学. 2015(08)
[2]甜椒脉斑驳病毒（PVMV）在海南的发现与检测[J]. 梁洁,王健华,章绍延,余乃通,张雨良,王祥,刘志昕. 热带作物学报. 2015(05)
[3]重庆辣椒病毒病病原初步鉴定和分析[J]. 郭思瑶,童艳,黄娅,罗信福,青玲. 园艺学报. 2015(02)
[4]2.0%好普水剂防治辣椒病毒病的效果[J]. 张春冬. 安徽农业科学. 2015(04)
[5]几种新疆加工型辣椒种子病毒的检测和鉴定[J]. 张强,罗明,李克梅,张春竹,楚金平,马建江. 西南农业学报. 2014(06)
[6]辣椒抗黄瓜花叶病毒病研究进展[J]. 郭广君,刁卫平,刘金兵,潘宝贵,戈伟,王述彬. 华北农学报. 2014(S1)
[7]辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）新疆加工型辣椒分离物的鉴定和致病型分析[J]. 张强,张春竹,李克梅,罗明,楚金平. 中国农学通报. 2014(25)
[8]大蒜X病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立[J]. 赵桐,李长红,周前进,陈先锋,陈炯,陈剑平. 浙江农业学报. 2013(06)
[9]辣椒病毒病发生的综合治理[J]. 陈言. 蔬菜. 2013(09)
[10]中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异[J]. 高芳銮,沈建国,史凤阳,方治国,谢联辉,詹家绥. 中国农业科学. 2013(15)
硕士论文
[1]重庆辣椒病毒病的病原鉴定及多重RT-PCR检测体系的构建[D]. 黄娅.西南大学 2015
[2]新疆辣椒和茄子上两种病毒的分子鉴定[D]. 张建云.石河子大学 2013
[3]三种大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR检测研究[D]. 许蕊.甘肃农业大学 2012
[4]大蒜茎尖脱毒体系的建立与病毒电镜检测分析[D]. 马雯.甘肃农业大学 2011
[5]北疆大蒜病毒病的调查和洋葱黄矮病毒的鉴定及序列分析[D]. 陈栋.石河子大学 2008
本文编号：3337060
【文章来源】：湖南农业大学湖南省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
疑似感病辣椒FYg1symptomofsuspectedpepper
２．３．１辣椒叶片总ＲＮＡ提取??Ｗ湖南省长沙市湖南农业大学蔬菜基地、株洲市體陵县辣椒主产区疑似感病辣椒??叶片为材料（图１），提取总ＲＮＡ，通过１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测提取结果（图２），??结果表明，能清晰地看到总ＲＮＡ的２８Ｓ、１８Ｓ条带，且条带没有出现明显弥散，ＲＮＡ完??整性较好，能被后续实验使用。??Ｈ??图１疑似感病辣椒??Ｆｉｇ?１?ｓｙｍｐ化ｍ?ｏｆ?ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ?ｐｅｐｐｅｒ??１７??
椒病毒单重ＲＴ－ＰＣ民检测体系的建立??据北京全式金生物有限公司ＰＣＲ扩增试剂２?Ｘ?Ｔａｑ?Ｍａｓｔｅｒ?Ｍｉｘ常用的ＰＣＲ反应体??行辣椒ＴＳＷＶ、ＣＭＶ、ＴＭＶ、ＰＶＹ和ＢＢＷＶ－２单重ＰＣＲ扩增，针对扩增的结果，??ＰＣＲ反应的种种因素（如ＰＣＲ反应循环数、引物浓度等）进行适当调整，由不度的实验得出最适宜的退火温度，通过比较试验结果确定最佳单重ＰＣＲ反应体??序。单重ＰＣＲ体系组分包括２ＸＴａｑ?Ｍａｓｔｅｒ?Ｍｉｘ?１２．５?ＵＬ，上、下游特异性引物??，模板ＣＤＮＡ２?＂Ｌ，?ｄｄＥｂＱ补足至２５?ＵＬ。单重ＰＣ民反应程序为；９４°Ｃ预变９４°Ｃ变性３０ｓ；?５７’Ｃ退火３０ｓ；?７２°Ｃ延伸Ｉｍｉｎ；循环数为３５；最后７２°Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ用该体系对疑似感病辣椒样品进行单重ＲＴ－ＰＣＲ扩增，单重ＰＣ民扩增引物序列果表明，不能从样品中扩增出大小为２５化Ｐ?（ＴＳＷＶ）的特异性条带，能扩增??为３２３ｂｐ?（ＣＭＶ）、２巧?ｂｐ?（ＴＭＶ）、４８０ｂｐ?（ＰＶＹ）和?１０５７ｂｐ?（ＢＢＷＶ－２）条带，条带大小与试验设计相符，见图３、４、５、６，说明样品未被ＴＳＷＶ侵染，ＣＭＶ、ＴＭＶ、ＰＶＹ和ＢＢＷＶ－２侵染。运用该体系筛选出被ＣＭＶ、ＴＭＶ、ＰＶＹ??Ｖ－２四种病毒复合侵染的辣椒样品。??Ｍ?１?２?３?４?５?６?７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]贵州辣椒病毒病的种类检测[J]. 王莉爽,陈文,谭清群,陈小均,吴石平,何海永,杨学辉. 贵州农业科学. 2015(08)
[2]甜椒脉斑驳病毒（PVMV）在海南的发现与检测[J]. 梁洁,王健华,章绍延,余乃通,张雨良,王祥,刘志昕. 热带作物学报. 2015(05)
[3]重庆辣椒病毒病病原初步鉴定和分析[J]. 郭思瑶,童艳,黄娅,罗信福,青玲. 园艺学报. 2015(02)
[4]2.0%好普水剂防治辣椒病毒病的效果[J]. 张春冬. 安徽农业科学. 2015(04)
[5]几种新疆加工型辣椒种子病毒的检测和鉴定[J]. 张强,罗明,李克梅,张春竹,楚金平,马建江. 西南农业学报. 2014(06)
[6]辣椒抗黄瓜花叶病毒病研究进展[J]. 郭广君,刁卫平,刘金兵,潘宝贵,戈伟,王述彬. 华北农学报. 2014(S1)
[7]辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）新疆加工型辣椒分离物的鉴定和致病型分析[J]. 张强,张春竹,李克梅,罗明,楚金平. 中国农学通报. 2014(25)
[8]大蒜X病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立[J]. 赵桐,李长红,周前进,陈先锋,陈炯,陈剑平. 浙江农业学报. 2013(06)
[9]辣椒病毒病发生的综合治理[J]. 陈言. 蔬菜. 2013(09)
[10]中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异[J]. 高芳銮,沈建国,史凤阳,方治国,谢联辉,詹家绥. 中国农业科学. 2013(15)
硕士论文
[1]重庆辣椒病毒病的病原鉴定及多重RT-PCR检测体系的构建[D]. 黄娅.西南大学 2015
[2]新疆辣椒和茄子上两种病毒的分子鉴定[D]. 张建云.石河子大学 2013
[3]三种大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR检测研究[D]. 许蕊.甘肃农业大学 2012
[4]大蒜茎尖脱毒体系的建立与病毒电镜检测分析[D]. 马雯.甘肃农业大学 2011
[5]北疆大蒜病毒病的调查和洋葱黄矮病毒的鉴定及序列分析[D]. 陈栋.石河子大学 2008
本文编号：3337060
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