黄瓜CsPHB基因功能的初步分析
发布时间：2021-09-25 05:36
HD-ZIP Ⅲ类转录因子是高等植物所特有的一类转录因子,调控多种植物细胞的分化,如分生组织的形成、侧生器官极性的建立、维管组织细胞的分化等。到目前为止,大多数关于HD-ZIP Ⅲ基因的研究都主要集中在拟南芥、水稻和玉米等模式植物上,而在瓜类作物上的相关报道还很少。课题组通过前期基因的精细定位,鉴定了黄瓜卷叶突变体的候选基因为CsPHB（PHABULOSA）。本研究对该基因进行克隆,并构建植物表达载体,运用农杆菌介导的遗传转化初步验证该基因的功能。主要结果如下:1. CsPHB基因调控的黄瓜卷叶突变体表型分析黄瓜卷叶突变体与野生型相比在不同生育期均有明显差异,突变体纯合子的卷叶表型更加明显,杂合子属于中间型,说明CsPHB存在剂量效应;幼苗期突变体的主根长和侧根数均显著高于野生型,而株高、茎粗、叶面积和叶周长与野生型相比无显著差异,在结果期突变体的株高、茎粗、叶面积、叶周长均低于野生型。2. 黄瓜卷叶突变体结果期的茎组织切片观察通过组织切片观察,发现突变体与野生型茎的基本结构相同,均有9个大小不同的双韧维管束;统计500um的视野下导管直径大于50um的导管数量,发现突变体的木质部导管...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CsPHB的氨基酸序列及miRNA的互补位点G→A代表从野生型CCMC到突变体cul的单碱基突变
第二章试验材料与方法15图2-1单靶点sgRNA序列及位置Fig.2-1SingletargetsgRNAsequenceandlocationsgRNA-L：ATTGATAGGGATGTTAACAACCCAGCsgRNA-R：AAACGCTGGGTTGTTAACATCCCTAT下划线序列为敲除载体酶切后形成的粘性末端的互补序列。2.8.1.2载体线性化处理利用限制性核酸内切酶BsaI对载体pKSE401-cas9酶切，将载体pKSE401-cas9进行线性化处理，酶切体系为：16uLnuclease-freewater，2uL10XBuffer，1uLDNA(1μg/μL)，1uLBsaI，轻摇混合，37℃过夜酶切，65℃保温20min使酶失活，在酶切体系中加入CIAP去磷酸化处理，防止载体发生自连，琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。2.8.1.3载体的构建和鉴定将sgRNA-L和sgRNA-R各5uL混合于200uL的PCR管中，在PCR仪中65℃退火合成双链，用无缝克隆试剂盒将线性植物表达载体pKSE401-cas9与双链sgRNA连接，连接产物纯化回收转化大肠杆菌，PCR检测并测序鉴定正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101感受态。2.8.2双靶点载体的构建2.8.2.1靶点设计根据2.8.1.1的方法确定CsPHB基因合适的靶点序列：图2-2双靶点序列及位置Fig.2-2Doubletargetsequenceandlocation
第二章试验材料与方法15图2-1单靶点sgRNA序列及位置Fig.2-1SingletargetsgRNAsequenceandlocationsgRNA-L：ATTGATAGGGATGTTAACAACCCAGCsgRNA-R：AAACGCTGGGTTGTTAACATCCCTAT下划线序列为敲除载体酶切后形成的粘性末端的互补序列。2.8.1.2载体线性化处理利用限制性核酸内切酶BsaI对载体pKSE401-cas9酶切，将载体pKSE401-cas9进行线性化处理，酶切体系为：16uLnuclease-freewater，2uL10XBuffer，1uLDNA(1μg/μL)，1uLBsaI，轻摇混合，37℃过夜酶切，65℃保温20min使酶失活，在酶切体系中加入CIAP去磷酸化处理，防止载体发生自连，琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。2.8.1.3载体的构建和鉴定将sgRNA-L和sgRNA-R各5uL混合于200uL的PCR管中，在PCR仪中65℃退火合成双链，用无缝克隆试剂盒将线性植物表达载体pKSE401-cas9与双链sgRNA连接，连接产物纯化回收转化大肠杆菌，PCR检测并测序鉴定正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101感受态。2.8.2双靶点载体的构建2.8.2.1靶点设计根据2.8.1.1的方法确定CsPHB基因合适的靶点序列：图2-2双靶点序列及位置Fig.2-2Doubletargetsequenceandlocation
本文编号：3409197
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CsPHB的氨基酸序列及miRNA的互补位点G→A代表从野生型CCMC到突变体cul的单碱基突变
第二章试验材料与方法15图2-1单靶点sgRNA序列及位置Fig.2-1SingletargetsgRNAsequenceandlocationsgRNA-L：ATTGATAGGGATGTTAACAACCCAGCsgRNA-R：AAACGCTGGGTTGTTAACATCCCTAT下划线序列为敲除载体酶切后形成的粘性末端的互补序列。2.8.1.2载体线性化处理利用限制性核酸内切酶BsaI对载体pKSE401-cas9酶切，将载体pKSE401-cas9进行线性化处理，酶切体系为：16uLnuclease-freewater，2uL10XBuffer，1uLDNA(1μg/μL)，1uLBsaI，轻摇混合，37℃过夜酶切，65℃保温20min使酶失活，在酶切体系中加入CIAP去磷酸化处理，防止载体发生自连，琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。2.8.1.3载体的构建和鉴定将sgRNA-L和sgRNA-R各5uL混合于200uL的PCR管中，在PCR仪中65℃退火合成双链，用无缝克隆试剂盒将线性植物表达载体pKSE401-cas9与双链sgRNA连接，连接产物纯化回收转化大肠杆菌，PCR检测并测序鉴定正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101感受态。2.8.2双靶点载体的构建2.8.2.1靶点设计根据2.8.1.1的方法确定CsPHB基因合适的靶点序列：图2-2双靶点序列及位置Fig.2-2Doubletargetsequenceandlocation
第二章试验材料与方法15图2-1单靶点sgRNA序列及位置Fig.2-1SingletargetsgRNAsequenceandlocationsgRNA-L：ATTGATAGGGATGTTAACAACCCAGCsgRNA-R：AAACGCTGGGTTGTTAACATCCCTAT下划线序列为敲除载体酶切后形成的粘性末端的互补序列。2.8.1.2载体线性化处理利用限制性核酸内切酶BsaI对载体pKSE401-cas9酶切，将载体pKSE401-cas9进行线性化处理，酶切体系为：16uLnuclease-freewater，2uL10XBuffer，1uLDNA(1μg/μL)，1uLBsaI，轻摇混合，37℃过夜酶切，65℃保温20min使酶失活，在酶切体系中加入CIAP去磷酸化处理，防止载体发生自连，琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收。2.8.1.3载体的构建和鉴定将sgRNA-L和sgRNA-R各5uL混合于200uL的PCR管中，在PCR仪中65℃退火合成双链，用无缝克隆试剂盒将线性植物表达载体pKSE401-cas9与双链sgRNA连接，连接产物纯化回收转化大肠杆菌，PCR检测并测序鉴定正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101感受态。2.8.2双靶点载体的构建2.8.2.1靶点设计根据2.8.1.1的方法确定CsPHB基因合适的靶点序列：图2-2双靶点序列及位置Fig.2-2Doubletargetsequenceandlocation
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