梨果实酵母cDNA文库构建及BRs信号通路关键蛋白BZR1互作子的筛选与鉴定
发布时间：2021-10-13 08:39
果实贮藏时间的长短与果实中乙烯释放量的高低有着密切关系。‘南果梨’（Pyrus ussuriensis）是呼吸跃变型果实,其果实成熟受乙烯调控,近年来较多研究报道证实了乙烯可以与BRs（油菜素甾醇）相互作用影响果实发育成熟及贮藏时间,但目前的研究不能明确乙烯与BRs间的调控网络。我们发现用0.1 mg·L-1浓度的EBR（表油菜素甾醇）处理后‘南果梨’贮藏过程中乙烯生成量减少。为明确BRs与‘南果梨’果实贮藏间的关系,我们通过转录组测序发现,在‘南果梨’成熟前后（成熟期及室温贮藏10 d）5个BRs合成及信号转导通路相关基因BRU1-like, BES1/BZR1-like1, BES1/BZR1-like4, CYP450-90A1, BZR1表达存在差异。半定量PCR分析发现BZRl基因受乙烯抑制剂（1-MCP）的诱导。为了深入研究BZR1在果实成熟中的作用,我们构建了‘南果梨’果实cDNA文库并且以BZR1为诱饵进行了酵母双杂交筛选。主要结果如下：1.对‘南果梨’成熟前后转录组比较分析,发现5个BRs合成及信号转导通路相关基因（BRU1-like, BES1/BZR1-like1...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstracts
1 前言
1.1 油菜素甾醇的研究进展
1.2 BRs信号转导通路及通路元件
1.2.1 BRs信号转导通路
1.2.2 BRs信号转导通路中的元件
1.3 BRs与植物生长发育研究进展
1.3.1 BRs对抗逆性的影响
1.3.2 BRs对光形态建成的影响
1.3.3 BRs对根系生长的影响
1.3.4 BRs对花期的影响
1.3.5 BRs对衰老进程的影响
1.3.6 BRs对细胞伸长的影响
1.3.7 BRs对果实发育成熟的影响
1.4 乙烯对果实发育成熟的作用
1.5 BRs与其他激素间的关联
1.6 酵母双杂交技术原理
1.7 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料与试剂
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 菌种及载体
2.1.4 主要培养基及试剂配制方法
2.2 试验方法
2.2.1 ‘南果梨’果实EBR处理
2.2.2 ‘南果梨’果实1-MCP处理
2.2.3 ‘南果梨’果实乙烯利处理
2.2.4 ‘南果梨’果实硬度测定
2.2.5 ‘南果梨’果实乙烯生成量测定
2.2.6 ‘南果梨’果实总RNA提取
2.2.7 RNA反转录
2.2.8 半定量PCR
2.2.9 qRT-PCR
2.2.10 BZR1基因克隆
2.2.11 pGBKT_7-BZR1载体构建及自激活检验
2.2.12 ‘南果梨’酵母cDNA文库构建
2.2.13 文库质量计算
2.2.14 ‘南果梨’酵母双杂交及共转化验证
3 结果与分析
3.1 诱饵BZR1基因确定
3.1.1 EBR处理后果实乙烯生成量变化
3.1.2 乙烯利、1-MCP处理‘南果梨’果实后乙烯生成量及硬度变化
3.1.3 BRs合成及信号转导通路重要基因表达分析
3.1.4 pGBKT_7-BZR1载体自激活检验
3.2 ‘南果梨’果实cDNA文库构建
3.2.1 ‘南果梨’果实各时期总RNA提取
3.2.2 双链cDNA合成与纯化
3.2.3 cDNA文库构建及库质量计算
3.2.4 cDNA文库插入片段大小检测
3.3 ‘南果梨’酵母双杂交筛选
3.3.1 杂交效率计算
3.3.2 阳性克隆的筛选
3.3.3 BZR1互作蛋白的共转化验证
3.3.4 EBR处理后果实贮藏过程中ACO1相对表达量
4 讨论
4.1 EBR处理对果实成熟的影响
4.2 乙烯利、1-MCP处理‘南果梨’果实后BZR1表达分析
4.3 ‘南果梨’酵母cDNA文库构建
4.4 酵母双杂交筛选
5 全文结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母双杂交技术应用进展[J]. 王婷,葛怀娜,郭宏. 生物技术进展. 2015(05)
[2]转录因子调控果实成熟和衰老机制研究进展[J]. 范中奇,邝健飞,陆旺金,陈建业. 园艺学报. 2015(09)
[3]干旱胁迫下棉花幼苗转录因子BES1/BZR1对外源油菜素内酯的响应表达特征[J]. 安汶铠,常丹,张富春. 西北植物学报. 2015(07)
[4]2,4-表油菜素内酯（EBR）对网纹甜瓜光合特性和果实品质的影响[J]. 石瑜,汪俏梅,叶红霞,王翠,汪炳良. 核农学报. 2015(05)
[5]油菜素内酯的生物合成及信号转导研究进展[J]. 熊书. 教育教学论坛. 2015(19)
[6]高通量转录组测序技术及其在鳞翅目昆虫上的应用[J]. 杨帆,黄立华,张爱兵. 昆虫学报. 2014(08)
[7]油菜素内酯在植物生长发育中的作用机制研究进展[J]. 郑洁,王磊. 中国农业科技导报. 2014(01)
[8]油菜素甾醇信号转导的调控机制[J]. 王斐,何伟,闫海芳. 植物生理学报. 2013(12)
[9]油菜素内酯对火龙果果实生长和品质的影响[J]. 李洪波,王俊宁,陈奕杰,李润唐. 南方农业学报. 2013(07)
[10]bzr1基因的转化对番茄果实性状的影响[J]. 李振,魏佳,贾承国,汪俏梅. 中国农业科学. 2010(09)
硕士论文
[1]苹果ACC合成酶基因MdACS6在果实乙烯合成中的调控机制研究[D]. 李通.沈阳农业大学 2014
[2]BZR1在番茄果实不同成熟时期表达水平鉴定[D]. 沈爱华.湖南农业大学 2014
[3]油菜素内酯（BR）与Ca2+/CaM信号转导网络的关系[D]. 黄新.河北农业大学 2013
本文编号：3434322
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstracts
1 前言
1.1 油菜素甾醇的研究进展
1.2 BRs信号转导通路及通路元件
1.2.1 BRs信号转导通路
1.2.2 BRs信号转导通路中的元件
1.3 BRs与植物生长发育研究进展
1.3.1 BRs对抗逆性的影响
1.3.2 BRs对光形态建成的影响
1.3.3 BRs对根系生长的影响
1.3.4 BRs对花期的影响
1.3.5 BRs对衰老进程的影响
1.3.6 BRs对细胞伸长的影响
1.3.7 BRs对果实发育成熟的影响
1.4 乙烯对果实发育成熟的作用
1.5 BRs与其他激素间的关联
1.6 酵母双杂交技术原理
1.7 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料与试剂
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 菌种及载体
2.1.4 主要培养基及试剂配制方法
2.2 试验方法
2.2.1 ‘南果梨’果实EBR处理
2.2.2 ‘南果梨’果实1-MCP处理
2.2.3 ‘南果梨’果实乙烯利处理
2.2.4 ‘南果梨’果实硬度测定
2.2.5 ‘南果梨’果实乙烯生成量测定
2.2.6 ‘南果梨’果实总RNA提取
2.2.7 RNA反转录
2.2.8 半定量PCR
2.2.9 qRT-PCR
2.2.10 BZR1基因克隆
2.2.11 pGBKT_7-BZR1载体构建及自激活检验
2.2.12 ‘南果梨’酵母cDNA文库构建
2.2.13 文库质量计算
2.2.14 ‘南果梨’酵母双杂交及共转化验证
3 结果与分析
3.1 诱饵BZR1基因确定
3.1.1 EBR处理后果实乙烯生成量变化
3.1.2 乙烯利、1-MCP处理‘南果梨’果实后乙烯生成量及硬度变化
3.1.3 BRs合成及信号转导通路重要基因表达分析
3.1.4 pGBKT_7-BZR1载体自激活检验
3.2 ‘南果梨’果实cDNA文库构建
3.2.1 ‘南果梨’果实各时期总RNA提取
3.2.2 双链cDNA合成与纯化
3.2.3 cDNA文库构建及库质量计算
3.2.4 cDNA文库插入片段大小检测
3.3 ‘南果梨’酵母双杂交筛选
3.3.1 杂交效率计算
3.3.2 阳性克隆的筛选
3.3.3 BZR1互作蛋白的共转化验证
3.3.4 EBR处理后果实贮藏过程中ACO1相对表达量
4 讨论
4.1 EBR处理对果实成熟的影响
4.2 乙烯利、1-MCP处理‘南果梨’果实后BZR1表达分析
4.3 ‘南果梨’酵母cDNA文库构建
4.4 酵母双杂交筛选
5 全文结论
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母双杂交技术应用进展[J]. 王婷,葛怀娜,郭宏. 生物技术进展. 2015(05)
[2]转录因子调控果实成熟和衰老机制研究进展[J]. 范中奇,邝健飞,陆旺金,陈建业. 园艺学报. 2015(09)
[3]干旱胁迫下棉花幼苗转录因子BES1/BZR1对外源油菜素内酯的响应表达特征[J]. 安汶铠,常丹,张富春. 西北植物学报. 2015(07)
[4]2,4-表油菜素内酯（EBR）对网纹甜瓜光合特性和果实品质的影响[J]. 石瑜,汪俏梅,叶红霞,王翠,汪炳良. 核农学报. 2015(05)
[5]油菜素内酯的生物合成及信号转导研究进展[J]. 熊书. 教育教学论坛. 2015(19)
[6]高通量转录组测序技术及其在鳞翅目昆虫上的应用[J]. 杨帆,黄立华,张爱兵. 昆虫学报. 2014(08)
[7]油菜素内酯在植物生长发育中的作用机制研究进展[J]. 郑洁,王磊. 中国农业科技导报. 2014(01)
[8]油菜素甾醇信号转导的调控机制[J]. 王斐,何伟,闫海芳. 植物生理学报. 2013(12)
[9]油菜素内酯对火龙果果实生长和品质的影响[J]. 李洪波,王俊宁,陈奕杰,李润唐. 南方农业学报. 2013(07)
[10]bzr1基因的转化对番茄果实性状的影响[J]. 李振,魏佳,贾承国,汪俏梅. 中国农业科学. 2010(09)
硕士论文
[1]苹果ACC合成酶基因MdACS6在果实乙烯合成中的调控机制研究[D]. 李通.沈阳农业大学 2014
[2]BZR1在番茄果实不同成熟时期表达水平鉴定[D]. 沈爱华.湖南农业大学 2014
[3]油菜素内酯（BR）与Ca2+/CaM信号转导网络的关系[D]. 黄新.河北农业大学 2013
本文编号：3434322
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