茄子萼片花青素合成相关基因DFR和MYB的克隆及表达分析

发布时间：2021-11-06 13:44

　　茄子（Solanum melongena L.）作为大众餐桌上即为常见的菜,其富含大量花青素,具有很高的营养价值,其根、茎、叶和种子具有一定药用价值,其萼片也经常出现在餐桌上,具有很好的市场前景。本研究针对于欧洲绿萼茄,东北紫茄,及其两种茄子的杂交茄观察后发现,欧洲进口茄萼片整个生长周期内均为绿色,东北紫茄则随生长周期的推进,逐渐变为萼片全紫,而杂交品种则随生长周期,萼片也逐渐变紫,但并非全为紫色,而是紫、绿相间。本实验针对萼片为何会出现该种变化进行了如下研究及结果分析：1.选择三种茄子生长成熟的果实萼片作为实验材料。分别为全绿的欧洲绿萼品种茄子,东北紫萼品种茄子,及其绿、紫相间的杂交品种。采用RACE及同源克隆的方法分别克隆了这三个品种茄子DFR及MYB 6个基因的cDNA,命名为SmDFR和SmMYB。2.DFR和MYB基因分析欧洲绿萼SmDFR基因cDNA全长1016bp,从82bp-716bp为开放阅读框,编码213个氨基酸,登录号为KX224250;东北紫萼SmDFR基因cDNA全长1128bp,从332bp-973bp为开放阅读框,共213个氨基酸,登录号为KX224251... 

【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 引言
        1.1.1 欧洲绿萼茄
        1.1.2 东北紫萼茄
        1.1.3 杂交茄
    1.2 花青素概述
        1.2.1 花青素的合成途径
        1.2.2 花青素的生理功能作用机理
            1.2.2.1 对生产及畜牧业的作用
            1.2.2.2 在植物生长方面的作用
        1.2.3 二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol 4-Reductase,DFR)的研究
        1.2.4 MYB转录因子的研究
    1.3 研究的目的及意义
    1.4 研究的方法与技术路线
        1.4.1 研究方法
        1.4.2 技术路线
2 三种茄子中花青素合成途径中相关基因的克隆
    2.1 三种茄子的DFR和MYB基因保守区域的克隆
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 试验方法
            2.1.3.1 不同品种茄子萼片总RNA提取
            2.1.3.2 三种茄子DFR基因保守区域引物设计
            2.1.3.3 茄子萼片DFR基因3'RACE片段扩增
            2.1.3.4 PCR产物的回收与纯化
            2.1.3.5 载体连接与转化
            2.1.3.6 阳性克隆的筛选与鉴定
        2.1.4 结果与分析
            2.1.4.1 三种茄子萼片总RNA提取结果
            2.1.4.2 茄子DFR3'及MYB3'RACE的PCR扩增结果
            2.1.4.3 茄子DFR3'RACE阳性克隆菌液PCR检测结果
            2.1.4.4 茄子DFR3'及MYB3'RACE测序结果
    2.2 茄子DFR、MYB基因5'RACE片段克隆
        2.2.1 试验材料
        2.2.2 试验试剂
        2.2.3 试验方法
            2.2.3.1 三种茄子萼片总RNA的提取
            2.2.3.2 茄子6个DFR、MYB基因5'RACE引物设计
            2.2.3.3 三种茄子萼片总RNA的反转录
            2.2.3.4 cDNA模板的纯化
            2.2.3.5 cDNA模板的TdT加尾
            2.2.3.6 5'RACE巢式PCR反应
            2.2.3.7 目的片段的回收与连接转化
        2.2.4 结果与分析
            2.2.4.1 三种茄子萼片6个DFR、MYB基因5'RACE的PCR扩增结果
            2.2.4.2 三种茄子DFR、MYB基因5'RACE测序结果
    2.3 茄子DFR,MYB基因全长的获得
        2.3.1 试验材料
        2.3.2 试验试剂
        2.3.3 试验方法
        2.3.4 试验结果与分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
3 三种茄子DFR、MYB基因特征及系统进化分析
    3.1 三种茄子DFR、MYB基因的序列特征分析
        3.1.1 欧洲DFR基因序列结构分析及结构预测
        3.1.2 东北DFR基因序列结构分析及结构预测
        3.1.3 杂交DFR基因序列结构分析及结构预测
        3.1.4 欧洲MYB基因序列结构分析及结构预测
        3.1.5 东北MYB基因序列结构分析及结构预测
        3.1.6 杂交MYB基因序列结构分析及结构预测
    3.2 茄子DFR及MYB基因的同源性分析与系统进化分析
        3.2.1 茄子DFR基因的同源性分析与系统进化分析
        3.2.2 茄子MYB基因的同源性分析与系统进化分析
    3.3 讨论
    3.4 本章小结
4 三种茄子中DFR、MYB基因的Realtime PCR
    4.1 试验材料
    4.2 试验试剂与仪器
    4.3 试验方法
        4.3.1 三种茄子四个生长时期萼片总RNA的提取
        4.3.2 Realtime PCR模板cDNA的合成
        4.3.3 Realtime PCR引物的设计
        4.3.4 三种茄子中DFR,MYB基因的Realtime PCR检测
    4.4 结果与分析
        4.4.1 三种茄子DFR基因的Realtime PCR结果分析
        4.4.2 三种茄子MYB基因的Realtime PCR结果分析
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
5 三种茄子萼片的花青素含量测定
    5.1 三种茄子四个不同生长期的花青素含量测定
        5.1.1 试验材料
        5.1.2 试验试剂
        5.1.3 试验方法
    5.2 试验结果与分析
        5.2.1 三种茄子四个时期花青素含量结果
    5.3 讨论
    5.4 本章小结
6 三种茄子的MYB基因的转基因植株
    6.1 试验材料
        6.1.1 试验试剂
    6.2 试验方法
        6.2.1 三种茄子中3个MYB基因全长的扩增
            6.2.1.1 基因利用attB-GENE-F/R引物进行PCR
            6.2.1.2 利用attB-adapter-F/R引物进行二次PCR
            6.2.1.3 利用attB-adapter-目的基因PCR产物进行BP反应
            6.2.1.4 使用Top 10 Ecoli.Competent转化
            6.2.1.5 BP反应菌液PCR检测
            6.2.1.6 过表达Entry Clone质粒进行LR反应
            6.2.1.7 使用Top 10 Ecoli.Competent转化
            6.2.1.8 LR反应所得菌液PCR检测
        6.2.2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
            6.2.2.1 重组质粒三亲杂交法转入农杆菌
        6.2.3 蘸花法法遗传转化拟南芥
            6.2.3.1 野生型拟南芥的培养
            6.2.3.2 侵染野生型拟南芥
            6.2.3.3 转基因植株的筛选
    6.5 试验结果
        6.5.1 基因利用attB-GENE-F/R引物进行PCR
        6.5.2 农杆菌菌液PCR
    6.6 讨论
    6.7 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]植物二氢黄酮醇4-还原酶基因的研究进展[J]. 李春雷,崔国新,许志茹,李玉花.  生物技术通讯. 2009(03)
[2]植物花青素合成中的MYB蛋白[J]. 许志茹,李春雷,崔国新,孙燕.  植物生理学通讯. 2008(03)



本文编号：3479939