高羊茅Fa5GR基因克隆及其RNAi基因沉默体系的构建研究

发布时间：2021-11-27 04:32

　　高羊茅（Festuca arundinacea）原产西欧、北非,是温带地区广泛应用的草坪草和牧草。因其具有抗逆性强、耐践踏、耐粗放管理、绿期长、建坪快等特点,故被广泛应用于城市绿化、水土保持等方面。常见的暖季型草坪草和冷季型草坪草都有季节性“休眠”,人们在草坪草种选择时更倾向于绿期长的草种。冷季型草坪草在夏季的“休眠”现象是生产利用中的主要限制因素,延长绿色期是高羊茅草种选育的主要目标之一。本研究克隆高羊茅内源滞绿基因FaSGR基因片段,构建RNAi-FaSGR基因沉默载体系统,研究了农杆菌介导技术将该载体转入高羊茅体内表达,旨在获得绿期延长的高羊茅植株,为RNAi沉默技术编辑在草坪草遗传改良上的运用奠定实验基础。具体研究方法和主要结论如下：（1）高羊茅离体叶片黑暗处理6d时脯氨酸含量、丙二醛含量最高；相对叶绿素含量随着黑暗处理时间的延长而逐渐减少；叶片枯黄面积比例则反之。最终确定黑暗处理6d的高羊茅离体叶片作为提取RNA的材料,成功克隆到高羊茅FaSGR基因片段（1346 bp）。（2）高羊茅FaSGR基因片段的生物信息学分析发现,该基因片段与GenBank SGR参考序列（GenB... 

【文章来源】：湖南农业大学湖南省

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 高羊茅应用的研究进展
        1.1.1 高羊茅应用上的优势
        1.1.2 高羊茅研究进展
        1.1.3 高羊茅在生产应用存在的问题
    1.2 RNAi基因沉默研究进展
    1.3 滞绿基因研究进展
        1.3.1 滞绿突变体的发现及滞绿基因SGR的克隆
        1.3.2 SGR蛋白保守性
        1.3.3 滞绿基因SGR参与的叶绿素代谢途径
    1.4 论文研究目的与意义
第2章 实验材料与方法
    2.0 实验材料
    2.1 主要试剂和仪器
    2.2 培养基及菌株等
    2.3 生理生化实验测定指标方法
    2.4 高羊茅FaSGR基因的克隆
        2.4.1 引物设计
        2.4.2 高羊茅FaSGR基因的克隆和测序
        2.4.3 高羊茅FaSGR基因序列的分析
    2.5 高羊茅FaSGR基因沉默载体的构建
        2.5.1 引物设计
        2.5.2 目的片段的克隆和测序
        2.5.3 入门载体的构建
        2.5.4 pANDA-SGR载体构建
    2.6 高羊茅FaSGR-RNAi转基因体系的构建
        2.6.1 农杆菌细胞活化
        2.6.2 农杆菌感受态细胞的制备
        2.6.3 RNAi-FaSGR表达载体转入农杆菌感受态细胞
        2.6.4 根癌农杆菌转化条件的影响因素
    2.7 数据统计处理方法
第3章 结果与分析
    3.1 高羊茅FaSGR基因的克隆与分析
        3.1.1 高羊茅离体叶片黑暗处理实验
        3.1.2 高羊茅FaSGR基因获得与验证
    3.2 高羊茅FaSGR基因序列生物信息学分析
    3.3 高羊茅FaSGR基因沉默载体构建
        3.3.1 目的基因片段的获得
        3.3.2 入门载体阳性克隆检测
        3.3.3 表达载体的阳性克隆检测
    3.4 高羊茅FaSGR-RNAi转基因体系的构建
        3.4.1 平板培养基抗生素的浓度对农杆菌生长的影响
        3.4.2 转化农杆菌及其验证
        3.4.3 预培养培养基抗生素浓度的影响
        3.4.4 抗性愈伤组织的筛选
第4章 全文讨论
    4.1 高羊茅离体叶片的黑暗处理
    4.2 高羊茅FaSGR基因生物信息学分析
        4.2.1 生物信息学
        4.2.2 植物SGR基因生物学信息
    4.3 高羊茅FaSGR基因RNAi表达载体的构建
        4.3.1 RNAi载体构建方式
        4.3.2 植物RNAi载体系列
        4.3.3 构建SGR基因载体的启动子
    4.4 高羊茅FaSGR-RNAi转基因体系的构建
第5章 总结
    5.1 本研究主要结论
    5.2 本研究特色与创新之处
    5.3 后续研究工作展望
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3521558