黄瓜灰霉病PMA-qPCR方法及互作转录组学研究

发布时间：2021-12-09 07:14

　　黄瓜作为最有经济价值作物之一,在全球已经被广泛种植。然而,由灰葡萄孢菌引起的黄瓜灰霉病对黄瓜种植造成了严重的经济损失。除侵染黄瓜外,灰葡萄孢菌还可以侵染逾二百种植物。基于这个原因,我们展开了如下几个研究：（一）构建一个灰霉病的PMA-qPCR检测方法：（1）选用灰葡萄孢菌的P729基因为定量检测的靶基因,并以P729基因为目的基因构建克隆载体（2）设计定量引物并验证特异性,将克隆载体导入感受态细胞后扩繁培养,提取质粒作为标准品,根据其浓度将其稀释为5×100—5×106七个梯度绘制标准曲线（3）将构建好的方法用于患病叶片的检测,证明该方法可以快速准确的检测灰葡萄孢菌,为农业上的灰霉病的监测提供了有效的手段。（二）随着Hi-seq技术的出现,在转录组水平上研究植物-病原体互作也变得可能。据我们所知,本研究是第一次将转录组测序应用到黄瓜-灰葡萄孢菌互作来研究二者互作后基因表达的差异。总共,我们得到了248,908,688个原始序列,当去掉低质量,带接头和含有不确定碱基的序列后我们得到了238,341,648个高质量的序列,随后我们将这些序列分别比对到黄瓜和灰葡萄孢菌的参考基因组上。根据表达... 

【文章来源】：北京林业大学北京市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 黄瓜灰霉病及其病原菌
        1.1.1 灰霉病的危害与防治
        1.1.2 灰葡萄孢的致病机制
            1.1.2.1 侵入宿主表面
            1.1.2.2 侵入细胞壁杀死宿主细胞
            1.1.2.3 毒素
            1.1.2.4 草酸
            1.1.2.5 活性氧
            1.1.2.6 转化宿主组织
            1.1.2.7 酶类
            1.1.2.8 克服宿主的防御反应
    1.2 植物抵抗病原体的机制
        1.2.1 模式触发的免疫PTI
        1.2.2 触发的免疫效应ETI
    1.3 转录组测序研究植物病原体互作
        1.3.1 宿主或病原体转录组研究的发展
        1.3.2 转录组测序的优势
        1.3.3 病原体的转录组测序
        1.3.4 宿主的转录组测序
    1.4 转录调控对植物病原体互作的影响
    1.5 本研究的目的和意义
2 黄瓜灰霉病PMA-qPCR诊断方法构建
    2.1 材料和方法
        2.1.1 供试材料
        2.1.2 主要试剂及设备
        2.1.3 试验方法
            2.1.3.1 灰葡萄孢菌P729特异基因的扩增
            2.1.3.2 目的条带的回收与纯化
            2.1.3.3 回收条带测序鉴定
            2.1.3.4 荧光定量PCR引物设计和特异性验证
            2.1.3.5 标准品的构建
            2.1.3.6 Real—time PCR标准曲线的建立
            2.1.3.7 实际样本的检测
    2.2 结果
        2.2.1 灰葡萄孢菌P729基因的扩增
        2.2.2 荧光定量引物的特异性验证
        2.2.3 标准曲线的构建
        2.2.4 重复性分析
        2.2.5 实际样品的检测
    2.3 小结与讨论
3 黄瓜与灰葡萄孢菌互作转录组学分析
    3.1 实验材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 主要试剂和设备
        3.1.3 黄瓜的培养和侵染
            3.1.3.1 黄瓜种子的消毒
            3.1.3.2 黄瓜的培养和侵染
        3.1.4 RNA的提取
        3.1.5 总RNA的质量检测
        3.1.6 文库的构建及上机检测
        3.1.7 数据分析
            3.1.7.1 测序质量评估
            3.1.7.2 数据过滤
            3.1.7.3 序列比对到参考基因组
            3.1.7.4 基因表达水平分析和差异表达分析
            3.1.7.5 差异基因的GO富集分析和KEGG富集分析
        3.1.8 差异基因定量验证
    3.2 结果
        3.2.1 测序数据过滤
        3.2.2 将序列比对到参考基因组
        3.2.3 差异基因分析
        3.2.4 植物和病原体的差异基因的GO富集分析
            3.2.4.1 黄瓜GO富集分析
            3.2.4.2 灰葡萄孢菌的GO富集分析
        3.2.5 植物和病原体的KEGG富集分析
            3.2.5.1 黄瓜的差异基因的KEGG富集分析
            3.2.5.2 灰葡萄孢菌的差异基因的KEGG富集分析
        3.2.6 差异基因的qPCR验证
    3.3 小结与讨论
4 定量模型分析转录调控驱动黄瓜-灰葡萄孢菌互作
    4.1. 方法
        4.1.1 基于似然的混合模型
        4.1.2 通过EM算法估计
        4.1.3 实际数据
        4.1.4 假设检验
    4.2 结果
        4.2.1 聚类分组
        4.2.2 富集结果分析
    4.3 讨论
5 结论
参考文献
个人简介
导师简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]PMA-qPCR方法用于监测超声波灭菌效率的适用性及其应用[J]. 李聪聪,余以刚,邱杨,肖性龙,郭毅岱.  现代食品科技. 2012(04)
[2]源自不同寄主的灰葡萄孢生物学特性的比较研究[J]. 高智谋,李艳梅,李喜玲,章战华,营金凤.  菌物学报. 2009(03)



本文编号：3530186