酿酒葡萄赤霞珠果实苹果酸生物合成关键基因的克隆及功能鉴定
发布时间：2022-01-22 15:47
近些年来葡萄（Vitis vinifera L）果实中的有机酸含量因全球气候变暖而严重不足,果实的着色和风味受到不利影响,酿造的葡萄酒品质和口感欠佳,严重影响了葡萄酒产业的发展和经济效益。葡萄果实的有机酸中苹果酸含量较高,能被高效代谢,受外界环境因素的影响较大,研究酿酒葡萄苹果酸的合成与代谢、相关基因的表达调控显得尤为重要。本研究首先以宁夏地区栽培面积最大的酿酒葡萄品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）为材料,从果实形成至成熟4个发育时期的果实中提取RNA进行转录组测序,同时对同一时期的果实中与苹果酸关系比较密切的8种有机酸含量进行测定,筛选出影响赤霞珠果实中苹果酸生物合成的关键酶类及其基因,并对其进行分离克隆、原核细胞表达和体外酶活性检测;然后选择3个葡萄栽培基地的赤霞珠为材料,从4个发育时期的果实中提取RNA,对这些关键基因进行实时荧光定量PCR（qPCR）验证,并与同时期果实的有机酸含量进行显著性差异检验和相关性分析,进一步研究这些关键基因在葡萄不同栽培地区、果实不同发育时期,对苹果酸等有机酸生物合成与代谢的综合影响和调控机制。该研究为今后培育优质酿酒葡萄奠定了分子基...
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－３赤霞珠果实４个发育时期有机酸含量变化??注：数据为平均值±标准误，《＝３．??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｏｒｇａｎ?
Ｓｔａｇｅ?Ｓｔａｇｅ??图２－３赤霞珠果实４个发育时期有机酸含量变化??注：数据为平均值±标准误，《＝３．??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｏｒｇａｎｉｃ?ａｃｉｄｓ?ｃｏｎｔｅｎｔｓ?ａｔ?４?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ?ｓｔａｇｅｓ?ｏｆ?Ｃａｂｅｒｎｅｔ?Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ?ｆｒｕｉｔｓ??Ｎｏｔｅ?Ｄａｔａ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｍｅａｎｓ?士?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｅｒｒｏｒ．?？＝３．??２．２．４赤霞珠果实苹果酸生物合成关键基因的筛选??根据转录组二代测序结果，利用这８种相关酶类的功能基因及其同源基因在硬果期、绿果??期、转色期以及成熟期４个时期的基因表达量ＦＰＫＭ与同一样本的８种有机酸含量进行加权基??因共表达网络ＷＧＣＮＡ关联分析（图２－４）、韦恩差异基因表达分析筛选出与有机酸含量变化具??有较高相关性（ｒ＞±０．５）的基因为候选的关键基因（表２－４），进行下一步的基因克隆和功能验??证：其中，ＰＫ催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，其同源基因中基因表达量与磷酸烯醇式丙??酮酸、丙酮酸含量呈较高正相关关系的有６个，而与丙酮酸含量呈较高负相关关系的有４个，??选取?ＶＩＴ＿０８ｓ０００７ｇ０４１７０、ＶＩＴ＿１６ｓ００５０ｇ０２６６０?基因（ＣｓＰＡ７，?ＣｖＰＡ：２）；?ＰＤＨ?催化丙酮酸生成??乙酰辅酶Ａ，其同源基因中基因表达量与丙酮酸含量呈较高正负相关关系的各有５个，选取??ＶＩＴ＿０１ｓ００２６ｇ００９９０、ＶＩＴ＿ｌｌｓ００１６ｇ０１８７０?基因ＰＥＰＣ?催化磷酸烯醇式丙??酮酸生成草酰乙酸
宁夏大学硕士学位论文?第三章赤霞珠果实苹果酸生物合成关键基因的克隆和酶活性检３．１．３赤霞珠苹果酸生物合成关键基因的原核表达载体构建??３．１．３．１带有ｐＴｒｃ－ＣＫＳ载体相应末端序列的目的基因扩增??设计带有原核表达载体ｐＴｒｃ－ＣＫＳ限制性内切酶５ａ／ｗ／／?Ｉ和￡ｃｏ／？?Ｉ相应末端序列的引物，??以上一节克隆到ＴＡ载体携带目的基因的ｐＭＤ１８－Ｔ?Ｓｉｍｐｌｅ?Ｖｅｃｔｏｒ为模板，扩增１６个关键基（表?３－５）。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]气候变化对贺兰山东麓酿酒葡萄的影响及应对措施[J]. 李玉鼎,张光弟,李欣,冯彦彪,尹清雨. 中外葡萄与葡萄酒. 2019(01)
[2]植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展[J]. 王丽媛,张玉,徐明怡,冷海楠,伍一宁. 国土与自然资源研究. 2017(05)
[3]全球气候变暖对葡萄和葡萄酒品质的影响[J]. 刘敏,闵卓,鞠延仑,赵现方,房玉林. 北方园艺. 2017(04)
[4]贺兰山东麓酿酒葡萄中有机酸含量分析[J]. 杨春霞,刘元柏,葛谦. 食品科技. 2016(11)
[5]植物功能基因单核苷酸多态性的研究进展[J]. 张志鹏,王晓玥,黄少雄,张昭. 中国农学通报. 2016(20)
[6]不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果实中有机酸差异性研究[J]. 赵悦,韩宁,孙玉霞,孙庆扬,韩爱芹,赵新节. 食品工业科技. 2016(01)
[7]果实有机酸代谢研究进展[J]. 周先艳,朱春华,李进学,高俊燕,龚琪,沈正松,岳建强. 中国南方果树. 2015(01)
[8]L-苹果酸生物合成研究进展[J]. 吴军林,吴清平,张菊梅,张文,莫树平,柏建玲. 食品科学. 2014(03)
[9]不同品种酿酒葡萄有机酸含量分析[J]. 成冰,张京芳,徐洪宇,侯力璇,王月晖,张颜,王成. 食品科学. 2013(12)
[10]HPLC法测定贺兰山东麓酿酒葡萄中苹果酸含量[J]. 罗阳,贺晓光,杨军,杨波. 安徽农业科学. 2011(33)
博士论文
[1]鲜食葡萄果实糖酸组分遗传及葡萄糖苷酶基因的表达研究[D]. 张国军.中国农业大学 2013
硕士论文
[1]河北昌黎5个酿酒葡萄品种比较研究[D]. 陈海菊.西北农林科技大学 2010
本文编号：3602475
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－３赤霞珠果实４个发育时期有机酸含量变化??注：数据为平均值±标准误，《＝３．??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｏｒｇａｎ?
Ｓｔａｇｅ?Ｓｔａｇｅ??图２－３赤霞珠果实４个发育时期有机酸含量变化??注：数据为平均值±标准误，《＝３．??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｏｒｇａｎｉｃ?ａｃｉｄｓ?ｃｏｎｔｅｎｔｓ?ａｔ?４?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ?ｓｔａｇｅｓ?ｏｆ?Ｃａｂｅｒｎｅｔ?Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ?ｆｒｕｉｔｓ??Ｎｏｔｅ?Ｄａｔａ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｍｅａｎｓ?士?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｅｒｒｏｒ．?？＝３．??２．２．４赤霞珠果实苹果酸生物合成关键基因的筛选??根据转录组二代测序结果，利用这８种相关酶类的功能基因及其同源基因在硬果期、绿果??期、转色期以及成熟期４个时期的基因表达量ＦＰＫＭ与同一样本的８种有机酸含量进行加权基??因共表达网络ＷＧＣＮＡ关联分析（图２－４）、韦恩差异基因表达分析筛选出与有机酸含量变化具??有较高相关性（ｒ＞±０．５）的基因为候选的关键基因（表２－４），进行下一步的基因克隆和功能验??证：其中，ＰＫ催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，其同源基因中基因表达量与磷酸烯醇式丙??酮酸、丙酮酸含量呈较高正相关关系的有６个，而与丙酮酸含量呈较高负相关关系的有４个，??选取?ＶＩＴ＿０８ｓ０００７ｇ０４１７０、ＶＩＴ＿１６ｓ００５０ｇ０２６６０?基因（ＣｓＰＡ７，?ＣｖＰＡ：２）；?ＰＤＨ?催化丙酮酸生成??乙酰辅酶Ａ，其同源基因中基因表达量与丙酮酸含量呈较高正负相关关系的各有５个，选取??ＶＩＴ＿０１ｓ００２６ｇ００９９０、ＶＩＴ＿ｌｌｓ００１６ｇ０１８７０?基因ＰＥＰＣ?催化磷酸烯醇式丙??酮酸生成草酰乙酸
宁夏大学硕士学位论文?第三章赤霞珠果实苹果酸生物合成关键基因的克隆和酶活性检３．１．３赤霞珠苹果酸生物合成关键基因的原核表达载体构建??３．１．３．１带有ｐＴｒｃ－ＣＫＳ载体相应末端序列的目的基因扩增??设计带有原核表达载体ｐＴｒｃ－ＣＫＳ限制性内切酶５ａ／ｗ／／?Ｉ和￡ｃｏ／？?Ｉ相应末端序列的引物，??以上一节克隆到ＴＡ载体携带目的基因的ｐＭＤ１８－Ｔ?Ｓｉｍｐｌｅ?Ｖｅｃｔｏｒ为模板，扩增１６个关键基（表?３－５）。??
【参考文献】：
期刊论文
[1]气候变化对贺兰山东麓酿酒葡萄的影响及应对措施[J]. 李玉鼎,张光弟,李欣,冯彦彪,尹清雨. 中外葡萄与葡萄酒. 2019(01)
[2]植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展[J]. 王丽媛,张玉,徐明怡,冷海楠,伍一宁. 国土与自然资源研究. 2017(05)
[3]全球气候变暖对葡萄和葡萄酒品质的影响[J]. 刘敏,闵卓,鞠延仑,赵现方,房玉林. 北方园艺. 2017(04)
[4]贺兰山东麓酿酒葡萄中有机酸含量分析[J]. 杨春霞,刘元柏,葛谦. 食品科技. 2016(11)
[5]植物功能基因单核苷酸多态性的研究进展[J]. 张志鹏,王晓玥,黄少雄,张昭. 中国农学通报. 2016(20)
[6]不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果实中有机酸差异性研究[J]. 赵悦,韩宁,孙玉霞,孙庆扬,韩爱芹,赵新节. 食品工业科技. 2016(01)
[7]果实有机酸代谢研究进展[J]. 周先艳,朱春华,李进学,高俊燕,龚琪,沈正松,岳建强. 中国南方果树. 2015(01)
[8]L-苹果酸生物合成研究进展[J]. 吴军林,吴清平,张菊梅,张文,莫树平,柏建玲. 食品科学. 2014(03)
[9]不同品种酿酒葡萄有机酸含量分析[J]. 成冰,张京芳,徐洪宇,侯力璇,王月晖,张颜,王成. 食品科学. 2013(12)
[10]HPLC法测定贺兰山东麓酿酒葡萄中苹果酸含量[J]. 罗阳,贺晓光,杨军,杨波. 安徽农业科学. 2011(33)
博士论文
[1]鲜食葡萄果实糖酸组分遗传及葡萄糖苷酶基因的表达研究[D]. 张国军.中国农业大学 2013
硕士论文
[1]河北昌黎5个酿酒葡萄品种比较研究[D]. 陈海菊.西北农林科技大学 2010
本文编号：3602475
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