南瓜CmHKT1;1提高黄瓜嫁接苗耐盐性的机理及相关microRNAs鉴定

发布时间：2022-01-27 04:56

　　采用抗性砧木嫁接是黄瓜等果菜类蔬菜应对非生物胁迫抗性的有效措施。课题组前期发现南瓜砧木嫁接可以提高黄瓜耐盐性,根本原因是南瓜砧木限制了Na⁺向地上部黄瓜接穗运输,但是相关分子机制尚不明晰。HKT1蛋白是一类Na⁺转运蛋白,主要功能是限制Na⁺向木质部装载,减少木质部Na⁺含量。但是南瓜HKT基因在黄瓜嫁接苗中耐盐中的作用尚不明确。microRNA是一类广泛参与植物逆境胁迫的非编码RNA,在黄瓜嫁接苗耐盐过程中的响应及调控机制也不清楚。因此本研究从南瓜砧木对嫁接苗Na⁺分配机制的影响、南瓜离子转运蛋白CmHKT1;1的功能解析、黄瓜嫁接苗microRNA对盐胁迫的响应及调控网络等三个方面开展,取得结果如下:1.耐盐南瓜砧木是限制Na⁺向盐敏感黄瓜接穗运输的关键,砧木和接穗相互影响嫁接黄瓜幼苗Na⁺的积累。通过构建南瓜和黄瓜正反嫁接组合,在75 mM NaCl下处理120 h,发现以耐盐南瓜为砧木的嫁接组合可有效限制Na⁺

【文章来源】：华中农业大学湖北省211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
    1.1 课题的提出
    1.2 国内外研究进展
        1.2.1 盐胁迫对植物的伤害机制
        1.2.2 植物对盐胁迫的耐受机制
        1.2.3 嫁接提高植物耐盐机制
        1.2.4 植物Na~+转运及相关基因功能
        1.2.5 HKT蛋白是限制Na~+向地上部运输的关键基因
        1.2.6 CRISPR/Cas9 系统在瓜类作物上的应用
        1.2.7 microRNA与盐胁迫
        1.2.8 植物microRNA的长距离移动
    1.3 本研究的目的意义和内容
        1.3.1 目的和意义
        1.3.2 研究内容
第二章 南瓜砧木在黄瓜嫁接苗耐盐过程中的关键作用
    2.1 材料和方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 嫁接苗培养和NaCl处理
        2.1.3 Na~+,K~+含量测定
        2.1.4 统计分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 NaCl处理下嫁接苗不同组织中Na~+的含量
        2.2.2 NaCl处理下嫁接苗Na~+的积累过程
    2.3 讨论
        2.3.1 耐盐南瓜砧木是限制Na~+向接穗运输的关键
        2.3.2 黄瓜嫁接苗在耐盐过程中存在砧穗互作
    2.4 小结
第三章 南瓜CmHTK1;1在嫁接黄瓜耐盐过程中的功能分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 常用培养基和营养液的配制
        3.1.3 嫁接苗培养和NaCl处理
        3.1.4 植株形态及生理参数测定
        3.1.5 Na~+,K~+含量测定
        3.1.6 南瓜HKT基因的克隆及表达分析
        3.1.7 进化树构建
        3.1.8 亚细胞定位
        3.1.9 原位杂交
        3.1.10 CmHKT1;1在酵母中的异源功能验证
        3.1.11 超表达载体构建及黄瓜的遗传转化
        3.1.12 拟南芥转化和筛选
        3.1.13 Na~+的染色观测
        3.1.14 统计分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 南瓜HKT基因的鉴定
        3.2.2 盐胁迫下CmHKT1;1的表达分析
        3.2.3 CmHKT1;1的表达定位分析
        3.2.4 CmHKT1;1的离子转运特性鉴定
        3.2.5 盐胁迫下CmHKT1;1的生物学功能分析
    3.3 讨论
        3.3.1 CmHKT1;1是Na~+特异性转运蛋白
        3.3.2 超表达CmHKT1;1增强黄瓜耐盐性
        3.3.3 CmHKT1;1通过砧木限制Na~+向接穗运输
    3.4 小结
第四章 根部HKT基因编辑对南瓜耐盐性的影响
    4.1 材料和方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 CRISPR/Cas9 表达载体构建
        4.1.3 发根农杆菌的转化
        4.1.4 发根农杆菌介导的南瓜根部转化
        4.1.5 基因编辑效率检测
        4.1.6 NaCl处理和取样
        4.1.7 Na~+、K~+含量测定
        4.1.8 统计分析
    4.2 结果和分析
        4.2.1 设计CmHKT1;1的sgRNA
        4.2.2 发根农杆菌介导的南瓜根部转化过程
        4.2.3 CmHKT1;1编辑效率检测
        4.2.4 南瓜根部CmHKT1;1基因编辑后对地上部Na~+影响
    4.3 讨论
        4.3.1 发根农杆菌可用于基因功能的研究
        4.3.2 CmHKT1;1限制了Na~+向地上部运输
    4.4 小结
第五章 miRNA在黄瓜嫁接苗耐盐性中鉴定及作用机制
    5.1 材料和方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 材料处理和取样
        5.1.3 Small RNA文库的构建和测序
        5.1.4 测序数据的处理分析
        5.1.5 microRNA的鉴定和差异表达分析
        5.1.6 microRNA靶基因预测
        5.1.7 GO分析及KEGG分析
        5.1.8 microRNA的实时荧光定量
    5.2 结果与分析
        5.2.1 small RNA序列的基本统计
        5.2.2 microRNA的鉴定
        5.2.3 黄瓜、南瓜中共有的microRNA鉴定
        5.2.4 嫁接苗中可能长距离转运的miRNA鉴定
        5.2.5 嫁接苗中响应盐胁迫的差异表达miRNA鉴定
        5.2.6 黄瓜/南瓜嫁接苗响应盐胁迫的miRNA靶基因的预测
        5.2.7 黄瓜嫁接苗差异miRNA靶基因功能富集分析
        5.2.8 黄瓜嫁接苗差异miRNA靶基因KEGG分析
        5.2.9 盐胁迫下黄瓜嫁接苗miRNA参与的激素调控网络
    5.3 讨论
        5.3.1 miRNA参与黄瓜嫁接苗耐盐过程
        5.3.2 利用高通量测序鉴定miRNA长距离移动的探讨
    5.4 小结
第六章 总结和展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
附录Ⅰ 附表1-3
附录Ⅱ 课题资助项目
附录Ⅲ 攻读博士期间发表论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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硕士论文
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[2]大豆根部特异表达的磷转运子基因GmPT4的功能分析[D]. 林志豪.华南农业大学 2016
[3]发根农杆菌K599侵染黄瓜形成转基因毛状根的初步研究及orf14基因的克隆[D]. 曹庆丰.杭州师范大学 2012



本文编号：3611805