糙皮侧耳乙醛脱氢酶基因poaldh1的分离与鉴定
发布时间：2022-02-10 13:57
乙醛脱氢酶通过参与生物体内乙醛的代谢过程,从而减轻乙醛对细胞的毒害作用。目前,尚未见有关糙皮侧耳乙醛脱氢酶基因的报道。本研究首次对糙皮侧耳的乙醛脱氢酶基因poaldh1进行了克隆和功能分析,旨在从抗逆境胁迫的角度来揭示糙皮侧耳原基形成的机理。本实验室前期通过对糙皮侧耳双核菌丝期和原基期进行基因差异表达分析,获得了一个可能编码乙醛脱氢酶的基因,并将其命名为poaldh1。首先,本文通过将前期获得的poaldh1基因的EST标签与糙皮侧耳PC15菌株的转录本进行比对分析,获得了poaldh1基因的编码区序列。然后通过反转录PCR（RT-PCR）方法,克隆得到了糙皮侧耳新831菌株的乙醛脱氢酶基因poaldh1,并对其进行了测序和初步的生物信息学分析。结果表明,该基因长度为2,016 bp,编码序列长度为1,437 bp,编码478个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列具有乙醛脱氢酶中高度保守的10肽序列、催化结构域及谷氨酸活性位点等保守区域。通过蛋白质功能预测和GO分析表明,POALDH1是一种NAD（P）+依赖型的乙醛脱氢酶。利用半定量PCR（SqRT-PCR）对poal...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
1 文献综述
1.1 食用菌中差异表达基因的研究
1.1.1 食用菌中差异表达基因的研究现状
1.1.2 糙皮侧耳中差异表达基因的研究现状
1.2 乙醛脱氢酶的概况
1.2.1 乙醛脱氢酶的分类
1.2.2 乙醛脱氢酶的结构
1.2.3 乙醛脱氢酶的催化机制
1.2.4 乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.5 植物中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.6 动物中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.7 细菌中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.8 真菌中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.3 乙醛脱氢酶在生物抗非生物胁迫中的研究进展
1.3.1 非生物胁迫及其影响
1.3.2 乙醛脱氢酶对非生物胁迫耐受性的影响研究
2 引言
2.1 研究依据及意义
2.2 实验技术路线
3 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆与生物信息学分析
3.1 材料和方法
3.1.1 实验材料
3.1.1.1 菌株和质粒
3.1.1.2 培养基
3.1.1.3 主要试剂
3.1.1.4 主要仪器
3.1.2 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆
3.1.2.1 引物设计
3.1.2.2 糙皮侧耳原基总RNA的提取
3.1.2.3 cDNA第一条链的合成
3.1.2.4 糙皮侧耳基因组DNA的提取
3.1.2.5 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆
3.1.2.6 PCR产物胶回收纯化
3.1.2.7 PCR回收产物与p MD19–T载体连接
3.1.2.8 连接产物转化感受态细胞
3.1.2.9 阳性克隆的筛选与鉴定
3.1.3 糙皮侧耳poaldh1 基因生物信息学分析
3.2 结果与分析
3.2.1 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆
3.2.2 糙皮侧耳poaldh1 基因生物信息学分析
3.3 本章小结
4 糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达研究
4.1 材料和方法
4.1.1 实验材料
4.1.1.1 菌株
4.1.1.2 培养基
4.1.1.3 主要试剂
4.1.1.4 主要仪器
4.1.2 糙皮侧耳poaldh1 基因表达模式分析
4.1.2.1 糙皮侧耳总RNA的提取
4.1.2.2 cDNA第一条链的合成
4.1.2.3 半定量RT-PCR
4.1.3 糙皮侧耳原基形成相关环境压力下poaldh1 基因的差异表达分析
4.1.3.1 糙皮侧耳原基形成相关环境压力
4.1.3.2 半定量RT-PCR
4.1.4 非生物胁迫下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析
4.1.4.1 设置非生物胁迫条件
4.1.4.2 糙皮侧耳菌丝长速及长势测定
4.1.4.3 半定量RT-PCR
4.2 结果与分析
4.2.1 糙皮侧耳poaldh1 基因表达模式分析结果
4.2.2 糙皮侧耳原基形成相关环境压力下poaldh1 基因的差异表达分析结果
4.2.2.1 光照刺激下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析
4.2.2.2 温差刺激下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析
4.2.3 非生物胁迫下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析结果
4.2.3.1 盐胁迫下糙皮侧耳菌丝的生长及poaldh1 基因的差异表达分析
4.2.3.2 干旱胁迫下糙皮侧耳菌丝的生长及poaldh1 基因的差异表达分析
4.3 本章小结
5 糙皮侧耳poaldh1 基因的原核表达研究
5.1 材料和方法
5.1.1 实验材料
5.1.1.1 质粒
5.1.1.2 培养基
5.1.1.3 主要试剂
5.1.1.4 主要仪器
5.1.1.5 主要溶液
5.1.2 pET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 重组质粒的构建
5.1.2.1 带有酶切位点poaldh1 片段的PCR扩增
5.1.2.2 poaldh1 基因的PCR产物回收纯化
5.1.2.3 poaldh1 片段与p ET22b(+)-P_(tac)表达载体连接
5.1.2.4 连接产物转化感受态细胞
5.1.2.5 重组质粒的提取和鉴定
5.1.3 poaldh1 基因的诱导表达和SDS-PAGE分析
5.1.3.1 poaldh1 基因的诱导表达
5.1.3.2 SDS-PAGE分析
5.1.4 粗酶液中乙醛脱氢酶酶活的测定
5.1.4.1 粗酶液蛋白浓度的测定
5.1.4.2 粗酶液中乙醛脱氢酶酶活的测定
5.1.5 重组菌E.coli-p ET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 乙醛耐受性测定
5.1.5.1 乙醛浓度梯度的设置
5.1.5.2 菌种活化
5.1.5.3 不同浓度乙醛下菌株的生长曲线测定
5.2 结果与分析
5.2.1 pET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 重组质粒的构建
5.2.2 poaldh1 基因的诱导表达和SDS-PAGE分析
5.2.3 粗酶液中乙醛脱氢酶酶活的测定
5.2.3.1 粗酶液蛋白浓度测定
5.2.3.2 粗酶液乙醛脱氢酶酶活的测定
5.2.4 重组菌E.coli-p ET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 乙醛耐受性测定结果
5.3 本章小结
6 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达载体和反义沉默载体的构建
6.1 材料和方法
6.1.1 实验材料
6.1.1.1 质粒
6.1.1.2 培养基
6.1.1.3 主要试剂
6.1.1.4 主要仪器
6.1.2 真核表达载体pCAMBIA1300 的改造
6.1.2.1 糙皮侧耳gpd启动子的克隆
6.1.2.2 克隆带有酶切位点的gpd启动子及hph片段
6.1.2.3 真核表达载体pCAMBIA1300 的改造
6.1.3 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默载体的构建
6.1.3.1 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默片段的克隆
6.1.3.2 糙皮侧耳poaldh1基因过表达和反义沉默片段与pPo-GPD连接
6.1.3.3 连接产物转化感受态细胞
6.1.3.4 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默载体的筛选与鉴定
6.2 结果与分析
6.2.1 糙皮侧耳gpd启动子的克隆
6.2.2 真核表达载体pCAMBIA1300 的改造
6.2.3 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默载体的构建
6.3 本章小结
7 农杆菌介导真核表达载体转化糙皮侧耳
7.1 材料和方法
7.1.1 实验材料
7.1.1.1 菌株和质粒
7.1.1.2 培养基
7.1.1.3 主要试剂
7.1.1.4 主要仪器
7.1.2 pPo-GPD-poaldh1+和pPo-GPD-poaldh1-转化农杆菌EHA
7.1.2.1 冻融法转化农杆菌EHA
7.1.2.2 农杆菌菌液PCR验证
7.1.3 糙皮侧耳潮霉素筛选浓度的确定
7.1.4 糙皮侧耳菌丝球的培养
7.1.5 农杆菌的培养
7.1.6 农杆菌与糙皮侧耳菌丝球共培养
7.1.7 糙皮侧耳转化子的初筛与复筛
7.2 结果与分析
7.2.1 pPo-GPD-poaldh1+和pPo-GPD-poaldh1-转化农杆菌EHA
7.2.2 糙皮侧耳潮霉素筛选浓度
7.3 本章小结
8 结论与讨论
8.1 主要结论
8.2 讨论
8.3 后续实验设想
参考文献
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]转乙醛脱氢酶基因ALDH棉花对干旱和高盐抗性研究[J]. 杨红兰,周雅,张道远. 新疆农业科学. 2015(07)
[2]逆境胁迫下苜蓿乙醛脱氢酶基因的表达[J]. 许文花,文亦芾,马向丽,罗富成,任健. 草原与草坪. 2014(04)
[3]ALDH1A1基因表达沉默对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用[J]. 吴爱兵,邓旭斌,杨志雄,沈湘,李姝君,黎明春,吴昆鹏. 现代肿瘤医学. 2014(02)
[4]醛脱氢酶超家族研究进展[J]. 李彩霞,吴朝霞,王立顺. 上海交通大学学报(医学版). 2013(06)
[5]透明质酸钠中蛋白质含量测定方法的比较[J]. 林玉珍. 生物技术世界. 2013(05)
[6]乙醛脱氢酶2与心血管疾病研究进展[J]. 潘强强,高琴,王洪巨. 中国老年学杂志. 2013(08)
[7]平菇菌种的制作技术[J]. 王秀建. 现代园艺. 2012(24)
[8]Functional Characterization of an Aldehyde Dehydrogenase Homologue in Rice[J]. YANG Sheng-hui1, NIU Xiang-li2, LUO Di1, CHEN Chang-dong1, YU Xu1, TANG Wei1, LU Bao-rong3 and LIU Yong-sheng1, 2 1 Key Laboratory for Bio-Resource and Eco-Environment, Minstry of Education/College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, P.R.China 2 College of Life Sciences, Chongqing University, Chongqing 400044, P.R.China 3 Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, Ministry of Education/Institute of Biodiversity Science, Fudan University, Shanghai 200433, P.R.China. Journal of Integrative Agriculture. 2012(09)
[9]淹涝胁迫对幼苗期大豆根系乙醇脱氢酶1基因和乙醛脱氢酶7基因表达的影响[J]. 沙向红,梁燕,严建萍,谭湘陵. 广东农业科学. 2011(18)
[10]羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析[J]. 李新玲,吴姝菊,王全伟. 草业学报. 2011(04)
博士论文
[1]基于DGE技术的糙皮侧耳生长发育相关基因的鉴定及功能研究[D]. 殷朝敏.华中农业大学 2015
硕士论文
[1]深海环境中乙醛降解菌及醛脱氢酶基因的多样性研究[D]. 商谢谢.厦门大学 2014
[2]非生物胁迫下棉花植物同源结构域（PHD）转录因子的研究[D]. 杨雷.石河子大学 2013
本文编号：3619003
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
1 文献综述
1.1 食用菌中差异表达基因的研究
1.1.1 食用菌中差异表达基因的研究现状
1.1.2 糙皮侧耳中差异表达基因的研究现状
1.2 乙醛脱氢酶的概况
1.2.1 乙醛脱氢酶的分类
1.2.2 乙醛脱氢酶的结构
1.2.3 乙醛脱氢酶的催化机制
1.2.4 乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.5 植物中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.6 动物中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.7 细菌中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.2.8 真菌中乙醛脱氢酶的生理功能研究
1.3 乙醛脱氢酶在生物抗非生物胁迫中的研究进展
1.3.1 非生物胁迫及其影响
1.3.2 乙醛脱氢酶对非生物胁迫耐受性的影响研究
2 引言
2.1 研究依据及意义
2.2 实验技术路线
3 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆与生物信息学分析
3.1 材料和方法
3.1.1 实验材料
3.1.1.1 菌株和质粒
3.1.1.2 培养基
3.1.1.3 主要试剂
3.1.1.4 主要仪器
3.1.2 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆
3.1.2.1 引物设计
3.1.2.2 糙皮侧耳原基总RNA的提取
3.1.2.3 cDNA第一条链的合成
3.1.2.4 糙皮侧耳基因组DNA的提取
3.1.2.5 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆
3.1.2.6 PCR产物胶回收纯化
3.1.2.7 PCR回收产物与p MD19–T载体连接
3.1.2.8 连接产物转化感受态细胞
3.1.2.9 阳性克隆的筛选与鉴定
3.1.3 糙皮侧耳poaldh1 基因生物信息学分析
3.2 结果与分析
3.2.1 糙皮侧耳poaldh1 基因的克隆
3.2.2 糙皮侧耳poaldh1 基因生物信息学分析
3.3 本章小结
4 糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达研究
4.1 材料和方法
4.1.1 实验材料
4.1.1.1 菌株
4.1.1.2 培养基
4.1.1.3 主要试剂
4.1.1.4 主要仪器
4.1.2 糙皮侧耳poaldh1 基因表达模式分析
4.1.2.1 糙皮侧耳总RNA的提取
4.1.2.2 cDNA第一条链的合成
4.1.2.3 半定量RT-PCR
4.1.3 糙皮侧耳原基形成相关环境压力下poaldh1 基因的差异表达分析
4.1.3.1 糙皮侧耳原基形成相关环境压力
4.1.3.2 半定量RT-PCR
4.1.4 非生物胁迫下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析
4.1.4.1 设置非生物胁迫条件
4.1.4.2 糙皮侧耳菌丝长速及长势测定
4.1.4.3 半定量RT-PCR
4.2 结果与分析
4.2.1 糙皮侧耳poaldh1 基因表达模式分析结果
4.2.2 糙皮侧耳原基形成相关环境压力下poaldh1 基因的差异表达分析结果
4.2.2.1 光照刺激下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析
4.2.2.2 温差刺激下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析
4.2.3 非生物胁迫下糙皮侧耳poaldh1 基因的差异表达分析结果
4.2.3.1 盐胁迫下糙皮侧耳菌丝的生长及poaldh1 基因的差异表达分析
4.2.3.2 干旱胁迫下糙皮侧耳菌丝的生长及poaldh1 基因的差异表达分析
4.3 本章小结
5 糙皮侧耳poaldh1 基因的原核表达研究
5.1 材料和方法
5.1.1 实验材料
5.1.1.1 质粒
5.1.1.2 培养基
5.1.1.3 主要试剂
5.1.1.4 主要仪器
5.1.1.5 主要溶液
5.1.2 pET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 重组质粒的构建
5.1.2.1 带有酶切位点poaldh1 片段的PCR扩增
5.1.2.2 poaldh1 基因的PCR产物回收纯化
5.1.2.3 poaldh1 片段与p ET22b(+)-P_(tac)表达载体连接
5.1.2.4 连接产物转化感受态细胞
5.1.2.5 重组质粒的提取和鉴定
5.1.3 poaldh1 基因的诱导表达和SDS-PAGE分析
5.1.3.1 poaldh1 基因的诱导表达
5.1.3.2 SDS-PAGE分析
5.1.4 粗酶液中乙醛脱氢酶酶活的测定
5.1.4.1 粗酶液蛋白浓度的测定
5.1.4.2 粗酶液中乙醛脱氢酶酶活的测定
5.1.5 重组菌E.coli-p ET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 乙醛耐受性测定
5.1.5.1 乙醛浓度梯度的设置
5.1.5.2 菌种活化
5.1.5.3 不同浓度乙醛下菌株的生长曲线测定
5.2 结果与分析
5.2.1 pET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 重组质粒的构建
5.2.2 poaldh1 基因的诱导表达和SDS-PAGE分析
5.2.3 粗酶液中乙醛脱氢酶酶活的测定
5.2.3.1 粗酶液蛋白浓度测定
5.2.3.2 粗酶液乙醛脱氢酶酶活的测定
5.2.4 重组菌E.coli-p ET22b(+)-P_(tac)-poaldh1 乙醛耐受性测定结果
5.3 本章小结
6 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达载体和反义沉默载体的构建
6.1 材料和方法
6.1.1 实验材料
6.1.1.1 质粒
6.1.1.2 培养基
6.1.1.3 主要试剂
6.1.1.4 主要仪器
6.1.2 真核表达载体pCAMBIA1300 的改造
6.1.2.1 糙皮侧耳gpd启动子的克隆
6.1.2.2 克隆带有酶切位点的gpd启动子及hph片段
6.1.2.3 真核表达载体pCAMBIA1300 的改造
6.1.3 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默载体的构建
6.1.3.1 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默片段的克隆
6.1.3.2 糙皮侧耳poaldh1基因过表达和反义沉默片段与pPo-GPD连接
6.1.3.3 连接产物转化感受态细胞
6.1.3.4 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默载体的筛选与鉴定
6.2 结果与分析
6.2.1 糙皮侧耳gpd启动子的克隆
6.2.2 真核表达载体pCAMBIA1300 的改造
6.2.3 糙皮侧耳poaldh1 基因过表达与反义沉默载体的构建
6.3 本章小结
7 农杆菌介导真核表达载体转化糙皮侧耳
7.1 材料和方法
7.1.1 实验材料
7.1.1.1 菌株和质粒
7.1.1.2 培养基
7.1.1.3 主要试剂
7.1.1.4 主要仪器
7.1.2 pPo-GPD-poaldh1+和pPo-GPD-poaldh1-转化农杆菌EHA
7.1.2.1 冻融法转化农杆菌EHA
7.1.2.2 农杆菌菌液PCR验证
7.1.3 糙皮侧耳潮霉素筛选浓度的确定
7.1.4 糙皮侧耳菌丝球的培养
7.1.5 农杆菌的培养
7.1.6 农杆菌与糙皮侧耳菌丝球共培养
7.1.7 糙皮侧耳转化子的初筛与复筛
7.2 结果与分析
7.2.1 pPo-GPD-poaldh1+和pPo-GPD-poaldh1-转化农杆菌EHA
7.2.2 糙皮侧耳潮霉素筛选浓度
7.3 本章小结
8 结论与讨论
8.1 主要结论
8.2 讨论
8.3 后续实验设想
参考文献
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]转乙醛脱氢酶基因ALDH棉花对干旱和高盐抗性研究[J]. 杨红兰,周雅,张道远. 新疆农业科学. 2015(07)
[2]逆境胁迫下苜蓿乙醛脱氢酶基因的表达[J]. 许文花,文亦芾,马向丽,罗富成,任健. 草原与草坪. 2014(04)
[3]ALDH1A1基因表达沉默对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用[J]. 吴爱兵,邓旭斌,杨志雄,沈湘,李姝君,黎明春,吴昆鹏. 现代肿瘤医学. 2014(02)
[4]醛脱氢酶超家族研究进展[J]. 李彩霞,吴朝霞,王立顺. 上海交通大学学报(医学版). 2013(06)
[5]透明质酸钠中蛋白质含量测定方法的比较[J]. 林玉珍. 生物技术世界. 2013(05)
[6]乙醛脱氢酶2与心血管疾病研究进展[J]. 潘强强,高琴,王洪巨. 中国老年学杂志. 2013(08)
[7]平菇菌种的制作技术[J]. 王秀建. 现代园艺. 2012(24)
[8]Functional Characterization of an Aldehyde Dehydrogenase Homologue in Rice[J]. YANG Sheng-hui1, NIU Xiang-li2, LUO Di1, CHEN Chang-dong1, YU Xu1, TANG Wei1, LU Bao-rong3 and LIU Yong-sheng1, 2 1 Key Laboratory for Bio-Resource and Eco-Environment, Minstry of Education/College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, P.R.China 2 College of Life Sciences, Chongqing University, Chongqing 400044, P.R.China 3 Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, Ministry of Education/Institute of Biodiversity Science, Fudan University, Shanghai 200433, P.R.China. Journal of Integrative Agriculture. 2012(09)
[9]淹涝胁迫对幼苗期大豆根系乙醇脱氢酶1基因和乙醛脱氢酶7基因表达的影响[J]. 沙向红,梁燕,严建萍,谭湘陵. 广东农业科学. 2011(18)
[10]羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析[J]. 李新玲,吴姝菊,王全伟. 草业学报. 2011(04)
博士论文
[1]基于DGE技术的糙皮侧耳生长发育相关基因的鉴定及功能研究[D]. 殷朝敏.华中农业大学 2015
硕士论文
[1]深海环境中乙醛降解菌及醛脱氢酶基因的多样性研究[D]. 商谢谢.厦门大学 2014
[2]非生物胁迫下棉花植物同源结构域（PHD）转录因子的研究[D]. 杨雷.石河子大学 2013
本文编号：3619003
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3619003.html
