梯棱羊肚菌AA1＿2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定
发布时间：2022-02-13 18:25
典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA11家族）,而AA12家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA12家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA12家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA12家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA12多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64k Da,表现出亚铁氧化酶（EC1.16.3.1）与漆酶（EC1.10.3.2）双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH4最高,漆酶活性在pH6...
【文章来源】：菌物学报. 2020,39(06)北大核心CSCD
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
MiFOX基因与其他已知属于AA1＿2家族的酶基因氨基酸序列系统发育进化树
利用荧光实时定量PCR方法对MiFOX在梯棱羊肚菌不同生长阶段的表达量进行相对定量和对比。结果显示，MiFOX基因在放置营养袋之前、放置营养袋之后和临近菇原基形成前的土壤菌丝中，以及营养袋菌丝中的相对表达量都较低，在菇原基和子实体中的相对表达量较高。在子实体阶段，菌柄与菌盖中的相对表达量接近。说明MiFOX可能在子实体形成和生长发育阶段起主要作用，而在摄取土壤和营养袋中养分的阶段的作用相对较小（图3）。2.3 大肠杆菌异源表达MiFOX酶蛋白的活性鉴定
MiFOX基因长度2 011bp，共有5个外显子、4个内含子（图1A）。由于MiFOX基因所属的梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株全基因组进行基因注释时是利用对应的cDNA标定外显子区域，因此外显子和内含子的起止位置是真实的。编码的蛋白序列长575个氨基酸，N端带有18个氨基酸的信号肽，该基因编码的蛋白可能是分泌型蛋白。生物信息学预测其分子量为63.6kDa，等电点为4.67。3D结构模型预测软件I-TASSER为MiFOX酶蛋白寻找到的最高相似度模板是啤酒酵母的AA1＿2家族多铜氧化酶Fet3p(PDB登录号1ZPU），有90%的区段比对上，比对上的区域中氨基酸序列相似度49%。预测的3D结构模型为不规则筒状，大体上呈三辐射形，有3对β-片层构成三叶螺旋桨形（图1B）。每对β-片层构成一个桨叶，相互贴近略呈平行夹板状。在3对β-片层中，中段和C端的两对β-片层较为典型，而N端的一对β-片层较不规整。3对β-片层之间由多个α-螺旋和不规则卷曲串起来。将MiFOX基因与其他已知的属于AA1＿2家族的酶基因进行氨基酸序列的系统发育分析（图2）。CAZy主页上至2020年2月15日为止已公布的389个被分类为AA1＿2家族的酶基因（http://www.cazy.org/AA1＿2＿all.html），均属于真核生物。剔除重复和无效序列后，得到382个有效的AA1＿2家族酶基因序列，加上梯棱羊肚菌另一菌株CCBAS932中的1个AA1＿2家族同源基因（GenBank登录号RPB13240），共384个AA1＿2家族的酶基因，将氨基酸序列进行比对后，构建系统发育进化树（图2）。梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株中的MiFOX（图2黑色箭头示）与CCBAS932菌株中的对应同源基因（图2空心箭头示）氨基酸序列和长度都完全相同，与其他丝状真菌如各种曲霉、镰刀菌等的AA1＿2家族酶基因在系统进化关系上相对较近，与大多数酵母中的AA1＿2家族酶基因在系统进化关系上相对较远。总体而言，同一个物种不同菌株的AA1＿2家族基因在氨基酸序列上高度相似或完全相同，仅在不同物种之间表现出相对较大的差异，说明AA1＿2酶基因是一个进化上较为保守的基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]四川羊肚菌人工栽培的现状分析[J]. 彭卫红,唐杰,何晓兰,陈影,谭昊. 食药用菌. 2016(03)
[2]草菇漆酶基因在子实体形成过程中的表达分析[J]. 茅文俊,李燕,周陈力,王莹,朱刚,鲍大鹏,汪滢. 食用菌学报. 2016(01)
[3]食(药)用真菌比较基因组分析揭示其生态特性[J]. 吴冰,章小灵,崔宝凯,戴玉成. 菌物学报. 2015(04)
[4]糙皮侧耳生长发育过程中漆酶基因家族的表达研究[J]. 卓睿,马富英,周帅,张晓昱. 菌物学报. 2015(04)
[5]与金针菇子实体发育有关的漆酶编码基因Fv-lac4的结构及表达差异分析[J]. 吴光美,严俊杰,杨志云,张婷鹃,谢宝贵. 基因组学与应用生物学. 2014(06)
[6]真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展[J]. 司静,李伟,崔宝凯,戴玉成. 生物技术通报. 2011(02)
博士论文
[1]漆酶在斑玉蕈菌丝生长和子实体发育中的功能研究[D]. 张津京.南京农业大学 2014
本文编号：3623694
【文章来源】：菌物学报. 2020,39(06)北大核心CSCD
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
MiFOX基因与其他已知属于AA1＿2家族的酶基因氨基酸序列系统发育进化树
利用荧光实时定量PCR方法对MiFOX在梯棱羊肚菌不同生长阶段的表达量进行相对定量和对比。结果显示，MiFOX基因在放置营养袋之前、放置营养袋之后和临近菇原基形成前的土壤菌丝中，以及营养袋菌丝中的相对表达量都较低，在菇原基和子实体中的相对表达量较高。在子实体阶段，菌柄与菌盖中的相对表达量接近。说明MiFOX可能在子实体形成和生长发育阶段起主要作用，而在摄取土壤和营养袋中养分的阶段的作用相对较小（图3）。2.3 大肠杆菌异源表达MiFOX酶蛋白的活性鉴定
MiFOX基因长度2 011bp，共有5个外显子、4个内含子（图1A）。由于MiFOX基因所属的梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株全基因组进行基因注释时是利用对应的cDNA标定外显子区域，因此外显子和内含子的起止位置是真实的。编码的蛋白序列长575个氨基酸，N端带有18个氨基酸的信号肽，该基因编码的蛋白可能是分泌型蛋白。生物信息学预测其分子量为63.6kDa，等电点为4.67。3D结构模型预测软件I-TASSER为MiFOX酶蛋白寻找到的最高相似度模板是啤酒酵母的AA1＿2家族多铜氧化酶Fet3p(PDB登录号1ZPU），有90%的区段比对上，比对上的区域中氨基酸序列相似度49%。预测的3D结构模型为不规则筒状，大体上呈三辐射形，有3对β-片层构成三叶螺旋桨形（图1B）。每对β-片层构成一个桨叶，相互贴近略呈平行夹板状。在3对β-片层中，中段和C端的两对β-片层较为典型，而N端的一对β-片层较不规整。3对β-片层之间由多个α-螺旋和不规则卷曲串起来。将MiFOX基因与其他已知的属于AA1＿2家族的酶基因进行氨基酸序列的系统发育分析（图2）。CAZy主页上至2020年2月15日为止已公布的389个被分类为AA1＿2家族的酶基因（http://www.cazy.org/AA1＿2＿all.html），均属于真核生物。剔除重复和无效序列后，得到382个有效的AA1＿2家族酶基因序列，加上梯棱羊肚菌另一菌株CCBAS932中的1个AA1＿2家族同源基因（GenBank登录号RPB13240），共384个AA1＿2家族的酶基因，将氨基酸序列进行比对后，构建系统发育进化树（图2）。梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株中的MiFOX（图2黑色箭头示）与CCBAS932菌株中的对应同源基因（图2空心箭头示）氨基酸序列和长度都完全相同，与其他丝状真菌如各种曲霉、镰刀菌等的AA1＿2家族酶基因在系统进化关系上相对较近，与大多数酵母中的AA1＿2家族酶基因在系统进化关系上相对较远。总体而言，同一个物种不同菌株的AA1＿2家族基因在氨基酸序列上高度相似或完全相同，仅在不同物种之间表现出相对较大的差异，说明AA1＿2酶基因是一个进化上较为保守的基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]四川羊肚菌人工栽培的现状分析[J]. 彭卫红,唐杰,何晓兰,陈影,谭昊. 食药用菌. 2016(03)
[2]草菇漆酶基因在子实体形成过程中的表达分析[J]. 茅文俊,李燕,周陈力,王莹,朱刚,鲍大鹏,汪滢. 食用菌学报. 2016(01)
[3]食(药)用真菌比较基因组分析揭示其生态特性[J]. 吴冰,章小灵,崔宝凯,戴玉成. 菌物学报. 2015(04)
[4]糙皮侧耳生长发育过程中漆酶基因家族的表达研究[J]. 卓睿,马富英,周帅,张晓昱. 菌物学报. 2015(04)
[5]与金针菇子实体发育有关的漆酶编码基因Fv-lac4的结构及表达差异分析[J]. 吴光美,严俊杰,杨志云,张婷鹃,谢宝贵. 基因组学与应用生物学. 2014(06)
[6]真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展[J]. 司静,李伟,崔宝凯,戴玉成. 生物技术通报. 2011(02)
博士论文
[1]漆酶在斑玉蕈菌丝生长和子实体发育中的功能研究[D]. 张津京.南京农业大学 2014
本文编号：3623694
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